昆蟲病原線蟲對二點委夜蛾致病力的研究

雷利平，南宮自艷，李立濤，董志平，王勤英*

(1.河北農業(yè)大學植保學院，河北保定 071000;2.河北省農林科學院谷子研究所，河北石家莊 050035)

二點委夜蛾Athetis lepigone M?schler屬鱗翅目夜蛾科，主要分布于日本、朝鮮、俄羅斯和歐洲等地(姜京宇等，2008)。2011年二點委夜蛾在我國夏玉米產區(qū)7個省市暴發(fā)，并造成缺苗斷壟和一定面積的毀種補苗，危害性極強(王振營等，2012)。二點委夜蛾幼蟲喜歡隱蔽和潮濕的麥秸和麥糠堆下，其幼蟲主要在夏玉米苗期造成危害，特別是3～5 葉期的玉米受害最重;幼蟲主要集中在寄主作物根基部為害，咬食根基部幼嫩組織，或在莖基蛀莖為害，導致幼苗死亡，嚴重為害時常造成補種或毀種現象(江幸福等，2011)。由于近年來很多地區(qū)麥收時推廣秸稈還田的耕作方式，小麥收獲后將麥秸和麥糠直接覆蓋在田間，給二點委夜蛾創(chuàng)造了很好的棲息環(huán)境，再加上該種害蟲喜歡在麥秸等覆蓋物下隱蔽為害，噴施化學農藥和撒毒土等防治方法均因為覆蓋物遮擋的原因效果不佳(王振營等，2012)。

昆蟲病原線蟲有可能被用來防治二點委夜蛾。昆蟲病原線蟲目前應用最多的是斯氏屬Steinernema和異小桿屬Heterorhabditis，它們腸道內分別攜帶有致病桿菌Xenorhabdus和發(fā)光桿菌Photorhabdus，與之形成共生關系。昆蟲病原線蟲侵染期幼蟲通過昆蟲口腔、肛門和氣門等自然開口或直接由表皮侵入昆蟲體內，在昆蟲血腔中釋放出共生菌，快速增殖并產生毒素，造成寄主患敗血癥死亡(Herbert and Goodrich-Blair，2007)。昆蟲病原線蟲具有主動尋找寄主昆蟲、專一性強和對環(huán)境安全等特點，特別是昆蟲病原線蟲在土壤中有較好的生存能力和擴散能力，對隱蔽性害蟲如地下害蟲、鉆蛀害蟲有著其它防治手段不可比擬的優(yōu)勢(Hazir et al.，2003)。為了探索利用昆蟲病原線蟲防治二點委夜蛾的可行性，本文通過室內生物測定，篩選對二點委夜蛾幼蟲高致病力的昆蟲病原線蟲，明確其最佳的侵染條件，為生產上應用昆蟲病原線蟲防治二點委夜蛾提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試線蟲

供試線蟲有Heterorhabditis bacteriophora HB8、H.bacteriophora HB140、Steinernema.carpocapsae NJ、S.carpocapsae HB310、S.lonqicaudum CW105和S.glaseri NC 均來自河北農業(yè)大學害蟲生物防治實驗室。選取的昆蟲病原線蟲在生測前均用大蠟螟進行活體擴繁，已保證較高的侵染活性(Malan et al.，2011)。

1.1.2 供試昆蟲

二點委夜蛾為河北農業(yè)大學害蟲生防實驗室飼養(yǎng)。在室內溫度為(25±1)℃，濕度(≥70%)光暗比(16∶8)的人工氣候培養(yǎng)箱中進行。二點委夜蛾成蟲用10%的蜂蜜水飼喂;幼蟲飼養(yǎng)參照一般夜蛾科飼養(yǎng)方法(王偉等，2011)，具體如下:用平底玻璃管飼養(yǎng)幼蟲，將初孵幼蟲用毛筆挑入加有棉鈴蟲人工飼料的平底管內，每管6 頭，棉塞塞緊管口，幼蟲長到3 齡后，轉移到裝有棉鈴蟲人工飼料的平底玻璃管中，每管1 頭，飼養(yǎng)直至化蛹。

1.2 研究方法

1.2.1 不同昆蟲病原線蟲種類對二點委夜蛾致病力的測定

選取二點委夜蛾5 齡幼蟲為測試對象，測定6種侵染期昆蟲病原線蟲的侵染力。參照Malan(2011)等的方法，具體步驟如下:24 孔板中墊兩層濕潤的濾紙，每孔加入50μL 的1000 IJs/mL 線蟲懸浮液和1 頭二點委夜蛾5 齡幼蟲。每處理重復3 次，每個重復20 頭供試昆蟲，并以不含線蟲的滅菌水作為對照，將各處理放入溫度為(25±1)℃，相對濕度為80%左右條件下的培養(yǎng)箱中。每隔24 h 檢查并記錄1 次二點委夜蛾幼蟲死亡情況，直至120 h。

1.2.2 二點委夜蛾不同發(fā)育階段對昆蟲病原線蟲的敏感性測定

以1.2.1 試驗部分篩選出的昆蟲病原線蟲品系為研究對象，分別以二點委夜蛾低齡幼蟲(3齡)、末齡幼蟲(5 齡)、預蛹期幼蟲、蛹為測試對象，測試不同發(fā)育階段的二點委夜蛾對H.bacteriophora HB8 線蟲的敏感性，測試方法同1.2.1。每隔24 h 檢查并記錄1 次二點委夜蛾死亡情況，直至120 h。

1.2.3 不同線蟲劑量對二點委夜蛾致病力的影響

以1.2.1 試驗部分篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲品系為研究對象，以二點委夜蛾5 齡幼蟲為試蟲，將篩選出的線蟲品系分別以與二點委夜蛾5齡幼蟲數量比為1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、50∶1的濃度，測定不同線蟲劑量對線蟲致病力的影響，生測方法同1.2.1，120 h 檢查并記錄二點委夜蛾幼蟲死亡情況。

1.2.4 不同溫度條件對線蟲致病力的影響

以1.2.1 試驗部分篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲品系為研究對象，以二點委夜蛾5 齡幼蟲為試蟲，設計5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃共7個不同溫度條件，測定不同溫度條件對線蟲致病力的影響，生測方法同1.2.1，放置于濕度為80%的恒溫箱內，120 h 檢查并記錄二點委夜蛾幼蟲死亡情況。

1.2.5 不同土壤濕度對線蟲致病力的影響

以1.2.1 試驗部分篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲品系為研究對象，二點委夜蛾5 齡幼蟲為供試昆蟲，試驗設計0.5%、1%、2%、5%、10%和15%共6個不同含水量的細砂土。具體步驟如下:在直徑11 cm×高7 cm 的塑料盒中放入5 cm的一定濕度的消毒細砂土，然后將10 頭二點委夜蛾5 齡幼蟲放入塑料盒中，并在其上部放入足夠人工飼料。每處理各6 盒，然后每盒滴入500μL的1 000 IJs/mL 線蟲懸浮液，置于(25±1)℃的恒溫箱中，同時設不加線蟲500μL 滅菌水作對照。120 h 檢查并記錄二點委夜蛾幼蟲死亡情況。

1.3 數據分析

所有數據采用Excel 進行統計處理分析。

2 結果與分析

2.1 不同昆蟲病原線蟲種類對二點委夜蛾致病力的

由表1 可以看出，不同昆蟲病原線蟲種類對二點委夜蛾5 齡幼蟲的致死率差異顯著，其中所選擇的異小桿屬線蟲要比斯氏屬的線蟲致病力高;并且，同一屬的線蟲之間不同線蟲品系對二點委夜蛾5 齡幼蟲的致死力也存在較大差異。綜合來看，從所選擇的6種線蟲品系中H.bacteriophora HB8 品系對二點委夜蛾5 齡幼蟲致死率最高，處理120 h 后試蟲校正死亡率為93.33%，對其有較強的控制作用，可以作為首選的線蟲品系應用于該種害蟲的生物防治工作中。

表1 6種昆蟲病原線蟲對二點委夜蛾幼蟲的致病力Table 1 Pathogenicity of six EPN species against A.lepigone larvae

2.2 二點委夜蛾不同發(fā)育階段對H.bacteriophora HB8 的敏感性測定

二點委夜蛾不同發(fā)育階段對H.bacteriophora HB8 線蟲的敏感性差異顯著。由表2 可以看出二點委夜蛾對H.bacteriophora HB8 線蟲最敏感時期為5 齡幼蟲，其次為3 齡幼蟲，經H.bacteriophora HB8 線蟲處理后120 h 的死亡率分別達到91.67%和78.18%。二點委夜蛾結繭的預蛹期和蛹期對H.bacteriophora HB8 線蟲均不敏感，120 h 的死亡率分別為20%和15%。

表2 不同蟲態(tài)的二點委夜蛾對H.bacteriophora HB8 線蟲的敏感性Table 2 Sensitivity of A.lepigone at different developmental stages to H.bacteriophora HB8

2.3 不同線蟲劑量對二點委夜蛾致病力的影響

將篩選出的H.bacteriophora HB8 線蟲品系分別以與二點委夜蛾5 齡幼蟲數量比為1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、50∶1 的濃度進行處理，測定不同線蟲劑量對線蟲致病力的影響。從圖1 可以看出在測試劑量范圍內，二點委夜蛾5 齡幼蟲的死亡率隨線蟲劑量的增加而上升。其中，當線蟲與寄主數量比為50∶1時，其致死率達到91.52%。毒力回歸方程為 y=4.7427+0.9348x(R2=0.6253)。

圖1 不同劑量H.bacteriophora HB8 對二點委夜蛾致病力的影響Fig.1 Pathogenicity of different dosages H.bacteriophora HB8 against A.lepigone

2.4 不同溫度條件對線蟲致病力的影響

在不同溫度條件下H.bacteriophora HB8 品系線蟲對二點委夜蛾5 齡幼蟲的致病力有顯著差異(圖2)。在10℃～30℃范圍內，隨著溫度的升高線蟲致病力不斷增強，當溫度為25℃和30℃時，致病力達到最高值，處理120 h 后試蟲的死亡率分別達到91.52%和90%，顯著高于其它溫度處理。當溫度為5℃時和35℃，線蟲處理120 h 后試蟲的死亡率均為0，說明在此溫度下線蟲失去了致病力。通過測定可以得出，H.bacteriophora HB8 品系線蟲對二點委夜蛾5 齡幼蟲適宜的侵染溫度為25℃～30℃。

圖2 溫度對H.bacteriophora HB8 線蟲致病力的影響Fig.2 Pathogenicity of H.bacteriophora HB8 at different temperature

2.5 不同土壤濕度對線蟲致病力的影響

在溫度為(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱內測定了不同土壤濕度條下H.bacteriophora HB8 線蟲對二點委夜蛾5 齡幼蟲致病力的影響，結果見圖3。由圖可以看出，在0.5%～15%濕度范圍內，該線蟲對二點委夜蛾5 齡幼蟲的致死率隨著濕度的增加而遞增，在15%的土壤濕度時，其致死率達到最大值76.27%。

圖3 不同土壤濕度下對線蟲致病力的影響Fig.3 Pathogenicity of H.bacteriophora HB8 at different soil moisture

3 結論與討論

在供試的6種線蟲中，H.bacteriophora HB8 線蟲品系對二點委夜蛾幼蟲的致死率最高，進一步測定H.bacteriophora HB8 對不同蟲態(tài)的二點委夜蛾的侵染力，發(fā)現該線蟲僅對二點委夜蛾幼蟲，特別是對5 齡幼蟲有較高的侵染力，而對結繭的預蛹和蛹則很低。Gaugler and Kaya(1990)的研究認為昆蟲病原線蟲對寄主昆蟲幼蟲的高侵染力有可能是由于幼蟲時期昆蟲的自然孔口比較多，對線蟲的侵染比較敏感。

土壤中昆蟲病原線蟲的基數對于有效控制害蟲的為害至關重要(劉樹森等，2010)。H.bacteriophora HB8 品系不同劑量對二點委夜蛾末齡幼蟲的致病力測定結果表明，在相同侵染時間內，線蟲對寄主昆蟲的致病力基本上是隨線蟲濃度的增高而增高，在所設5個劑量中，在線蟲劑量與寄主昆蟲比例為50∶1時的致病力最高。

溫度和濕度影響昆蟲病原線蟲的存活、生長發(fā)育、遷移活動、對寄主的侵染能力等(劉樹森等，2010)。本試驗測試結果是H.bacteriophora HB8 品系侵染二點委夜蛾末齡幼蟲適宜溫度在20℃～30℃，以30℃和25℃的致病力較高，此試驗結果與劉樹森(2010)等的研究結果相一致:異小桿線蟲滄州品系侵染暗黑鰓金龜幼蟲以30℃和25℃的致病力較高。本研究結果還證實當溫度為5℃和35℃時該線蟲已經喪失了侵染能力，這也與前人Bakonyi and Nagy(2000)、楊平和李素春(1988)的研究結果基本一致:5℃～10℃時線蟲基本上不活動，10℃以下線蟲不感染寄主;25℃時移動最活躍，25℃～30℃時是較理想的施用溫度范圍;35℃時線蟲喪失致病能力，線蟲甚至很快死亡。濕度也是影響線蟲防效的重要因子之一(余向陽等，2003)。土壤中含有一定水分，便于在土壤間隙形成水膜，有助于昆蟲病原線蟲在土壤中移動;土壤濕度還有可能影響線蟲的存活率(劉樹森等，2010)，在濕度過低的情況下，線蟲體內水分蒸發(fā)加快，線蟲的存活率明顯降低(余向陽等，2003)。本試驗結果顯示隨著濕度的增加，H.bacteriophora HB8 線蟲侵染活性呈上升趨勢。孫瑞紅(2004)等在針對H.indica LN2 線蟲對韭菜遲眼蕈蚊幼蟲侵染力的研究中也證實溫度和土壤含水量顯著影響線蟲的致病力。

目前，利用昆蟲病原線蟲防治二點委夜蛾的研究在國內還未見報道。本研究篩選出線蟲對二點委夜蛾致病力較高的線蟲品系—H.bacteriophora HB8，并且明確了該線蟲侵染的最佳條件為25℃～30℃溫度、15%土壤濕度，二點委夜蛾幼蟲特別是5 齡幼蟲對H.bacteriophora HB8 線蟲最敏感。以上結果僅僅初步證實H.bacteriophora HB8 對二點委夜蛾的防治有潛在的應用價值，但是還需要通過田間試驗對H.bacteriophora HB8 防治二點委夜蛾的田間效果進一步評價。

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