HPLC法同時(shí)測(cè)定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿的含量

孫海濤

HPLC法同時(shí)測(cè)定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿的含量

孫海濤

目的采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿的含量。方法使用Capcell C18 色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH3.0）（7：93）（磷酸鹽緩沖液配制：準(zhǔn)確量取磷酸二氫鉀3.402g溶解于1000mL水中，用磷酸調(diào)PH值至3.0），流速為0.8mL?min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，柱溫為40℃。結(jié)果苦參堿和氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.3118～4.6770μg和0.02976～0.44640μg范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好；平均回收率（n=6）分別為97.1 %和98.4%，RSD分別為0.24%和1.48%。結(jié)論本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為清熱通淋片的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

清熱通淋片；苦參堿，氧化苦參堿；高效液相色譜法

清熱通淋片主要成分是中藥制劑，分別為苦參、爵床、硼砂、白茅根四種中藥，或是含有提取物復(fù)方制劑，具有的臨床作用是解熱、利尿、通淋。較常用于下焦?jié)駸崴聼崃?。癥見(jiàn)：小便頻急、尿道刺痛、尿液混濁、口干苦等，以及急性下尿路泌尿系統(tǒng)感染見(jiàn)于上述癥狀者?？鄥⒅泻锌鄥A、氧化苦參堿等生物堿類(lèi)成分，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)、利尿的作用[1]。苦參中生物堿含量測(cè)定方法包括比色法，薄層色譜掃描法和高效液相色譜法等[2]。近些年發(fā)表的應(yīng)用高效液相色譜法的文章比較小，同時(shí)較多的文獻(xiàn)應(yīng)用C18色譜柱進(jìn)行檢測(cè)苦參堿含量等主要成分[3]或是應(yīng)用氨基色譜柱同時(shí)檢測(cè)氧化苦參堿含量和苦參堿含量，罕見(jiàn)應(yīng)用C18色譜柱時(shí)進(jìn)行氧化苦參堿及苦參堿文獻(xiàn)的報(bào)道。本文中所參考的文獻(xiàn)操作方法的流動(dòng)相，選取用同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化色譜，創(chuàng)建應(yīng)用反相高效液相色譜法，應(yīng)用C18色譜柱時(shí)進(jìn)行氧化苦參堿的含量檢測(cè)和復(fù)方制劑中苦參堿含量的檢測(cè)。本方法操作簡(jiǎn)便，精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

島津LC-2010高效液相色譜儀（包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣儀、真空脫氣儀、柱溫箱、Class VP色譜工作站、紫外檢測(cè)儀），AE-160型電子分析天平，AG-135型電子分析天平，KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。對(duì)照品為氧化苦參堿（生產(chǎn)批號(hào)批號(hào)110780- 200506）和苦參堿（產(chǎn)品批號(hào)為110805-200306）在中國(guó)藥品生物制品檢定所采購(gòu)；甲醇、磷酸均為色譜純。采用其它試劑為分析純，應(yīng)用的水為超純水。清熱通淋片（規(guī)格：片芯重0.39g，江西杏林白馬藥業(yè)有限公司）。

2 方法及結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液配制方法準(zhǔn)確量取15mg苦參堿作為對(duì)照品、準(zhǔn)確量取8mg氧化苦參堿作為對(duì)照品，放置在10mL量杯內(nèi)，加入適量的甲醇溶解同時(shí)稀釋到預(yù)定刻數(shù)，攪拌均勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取5mL混合后對(duì)照品溶液，放置在25mL量杯內(nèi)，用磷酸鹽緩沖液（PH3.0）稀釋至預(yù)定刻度攪拌均勻即可。

2.2 供試品溶液配制方法在進(jìn)行供試品溶液配制時(shí)應(yīng)去除包衣，準(zhǔn)確稱(chēng)量研磨成細(xì)粉末，準(zhǔn)確量取1.0g，放置在帶有瓶塞的圓錐瓶中，準(zhǔn)確量取50mL三氯甲烷加入，量取1mL濃氨試液加入置具塞錐形瓶中，密閉瓶塞充分?jǐn)嚢杈鶆虿⑶异o止24小時(shí)以上，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30分鐘，冷卻再次進(jìn)行稱(chēng)重，同時(shí)應(yīng)用三氯甲烷充填補(bǔ)足缺少的劑量充分?jǐn)嚢杈鶆?，進(jìn)行濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25mL，回收溶劑至干，立即取下，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，轉(zhuǎn)移至l0mL量瓶中，加磷酸鹽緩沖液（PH3.0）稀釋至預(yù)計(jì)刻度，充分?jǐn)嚢杈鶆蛲瑫r(shí)進(jìn)行過(guò)濾，即可獲得所需溶液。

2.3 陰性樣品溶液配制方法準(zhǔn)確量取苦參的陰性樣品，同“2.2”項(xiàng)下方法操作，配制獲得陰性樣品溶液。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線(xiàn)性相關(guān)性分析精密量取對(duì)照品含量溶液劑量分別為1μL、3μL、5μL、10μL、15μL，依次注入相色譜儀內(nèi)，同時(shí)進(jìn)行峰面積的檢測(cè)，同時(shí)橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量（μg），縱坐標(biāo)為峰面積值，并且進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，苦參堿及氧化苦參堿的回歸方程計(jì)算為Y＝1039908.67X+3976.03，r＝1.0000；Y＝1028954.62X-1574.89，r＝1.0000，實(shí)踐結(jié)果顯示：苦參堿進(jìn)樣量在0.3118μg～4.6770μg，氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.02976μg～0.44640μg之間，同峰面積存在較好的線(xiàn)性相關(guān)。

2.5 精密度試驗(yàn)過(guò)程精確量取同種供試品的溶液，依據(jù)以上條件，反復(fù)進(jìn)行6次檢測(cè)，檢測(cè)峰面積。結(jié)果顯示苦參堿和氧化苦參堿峰面積的RSD（n=6）分別為0.84%，2.97%。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)精密度相對(duì)較好。

2.6 穩(wěn)定性的試驗(yàn)過(guò)程精確量取同種供試品溶液，依據(jù)以上條件分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h進(jìn)行精密檢測(cè)，同時(shí)對(duì)氧化苦參堿和苦參堿和峰面積的 RSD（n=7）分別為1.21%和1.47%。因此結(jié)果表明12小時(shí)內(nèi)的供試品溶液情況較為穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)方法準(zhǔn)確稱(chēng)取清熱通淋片（批號(hào)20121101）2g，共6份，依據(jù)“2.2”項(xiàng)配制方法量取供試品溶液，依據(jù)以上條件進(jìn)行檢驗(yàn)。實(shí)踐結(jié)果顯示苦參堿和氧化苦參堿的含量相加和的平均值為（n=6）分別為1.1mg?mL-1，RSD分別為0.48%，表明此方法重復(fù)性較好。

2.8 回收率試驗(yàn)方法準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的清熱通淋片（批號(hào)：20121101）粉末6份，每份0.5g，每份分別精密加入含苦參堿1.347mg·mL-1和氧化苦參堿0.194mg?mL-1的加入1mL對(duì)照品的甲醇溶液，依據(jù)“2.2” 項(xiàng)配制方法量取試驗(yàn)需要溶液，依據(jù)以上條件進(jìn)行檢驗(yàn)分析檢測(cè)，計(jì)算和回收。

2.9 樣品測(cè)定率結(jié)果苦參堿和氧化苦參堿的平均回收率（n=6）分別為97.1%和98.4%，RSD分別為0.24%和1.48%。

分別取不同批次的清熱通淋片，依據(jù)“2.2” 項(xiàng)配制方法量取供試品溶液。精密量取5μL供試品溶液，依據(jù)以上條件進(jìn)行檢驗(yàn)分析檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行峰面積的測(cè)定，同時(shí)應(yīng)用外標(biāo)方法進(jìn)行計(jì)算氧化苦參堿和苦參堿精確含量，實(shí)踐結(jié)果分析顯示3批樣品含量為苦參堿和氧化苦參堿之和分別為1.14、1.13、2.37mg?mL-1。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

3.2 供試品制備方法的選擇分別對(duì)采用光譜掃描針對(duì)氧化苦參堿和苦參堿進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)試驗(yàn)掃描結(jié)果顯示，同時(shí)依據(jù)2010年版中國(guó)藥典中的苦參藥材含量檢測(cè)波長(zhǎng)[1]，故制定測(cè)定波長(zhǎng)為220nm。

選用樣品為濃氨試液-氯仿超聲、鹽酸-甲醇超聲、濃氨試液-甲醇超聲。實(shí)踐結(jié)果證明，鹽酸-甲醇超聲掃描含有較多的雜質(zhì)，不能正常進(jìn)行分析；所以采用濃氨試液-甲醇超聲提取的結(jié)果顯示含量最高，但掃描含有較多的雜質(zhì)，不能達(dá)到和接近標(biāo)準(zhǔn)基線(xiàn)分離；應(yīng)用濃氨試液-氯仿超聲掃描檢測(cè)，可相對(duì)較高提取含量，同時(shí)在進(jìn)行掃描檢測(cè)時(shí)存在較少雜質(zhì)，相對(duì)較好的樣品分離度，因此采用濃氨試液-氯仿為標(biāo)準(zhǔn)的提取溶劑。

3.3 色譜柱的考察中國(guó)藥典2010版一部中藥材“苦參”含量測(cè)定項(xiàng)下采用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱同時(shí)測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿[1]，氨基鍵合硅膠柱較少應(yīng)用，推廣起來(lái)受一定限制，并且試驗(yàn)結(jié)果表明，使用氨基鍵合硅膠柱出峰較快，難于分離成分復(fù)雜樣品。故本文建立了一種全新的采用普通C18柱同時(shí)測(cè)定處方中苦參堿和氧化苦參堿的方法。

3.4 分離條件的選擇采用C18色譜柱比較不同的流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)PH值至8.0）、乙腈-磷酸鹽緩沖液（PH6.8）-三乙胺、甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH3.0）。結(jié)果表明，以甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH3.0）平衡時(shí)間短，分離效果佳，該流動(dòng)相可使苦參堿和氧化苦參堿均能達(dá)到基線(xiàn)分離。

3.5 選擇進(jìn)樣量的方法因供試品溶液的流動(dòng)相和極性的極性存在比較大差異性，過(guò)大的進(jìn)樣量會(huì)導(dǎo)致峰型較差，發(fā)生分裂及峰變寬，過(guò)小的進(jìn)樣量會(huì)導(dǎo)引起不準(zhǔn)確的進(jìn)樣，因此5μL為標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)樣量定最為合適。

3.6 小結(jié)本方法可以采用普通C18色譜柱準(zhǔn)確、靈敏的同時(shí)測(cè)定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿這兩種生物堿的含量，苦參堿和氧化苦參堿均能達(dá)到基線(xiàn)分離，重復(fù)性及回收率較好，結(jié)果可靠，為清熱通淋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中國(guó)藥典2010年版一部[S].北京：人民衛(wèi)生出版社,2010：188.

[2] 蔣珍藕.苦參堿的提取工藝及測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2005,11(08)：90.

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中國(guó)藥典2005年版一部[S].北京：人民衛(wèi)生出版社,2005：497.

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1673-5846(2013)06-0202-04

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