18F-SFB-Annexin B1探測化療后腫瘤細胞凋亡的實驗研究

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

18F-SFB-Annexin B1探測化療后腫瘤細胞凋亡的實驗研究

鄭宇佳 王明偉 張建平 徐俊彥 楊忠毅 程競儀 張勇平 章英劍

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

背景與目的：誘導細胞凋亡是腫瘤化療的機制之一，分子影像能在活體內(nèi)無創(chuàng)、動態(tài)地檢測細胞凋亡，有助于藥物篩選和療效分析。本研究旨在探討N-琥珀酰亞胺-4-氟苯甲酸酯偶聯(lián)的氟-18-膜聯(lián)蛋白B1(18F-SFB-AnnexinB1)顯像劑早期評價化療誘導細胞凋亡的可行性。方法：以SFB作為中間體將18F標記到AnnexinB1上。了解18F-SFB-Annexin B1在健康小鼠體內(nèi)的生物分布特性。建立Walker-256荷瘤小鼠模型，隨機分為兩組，化療組腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX 200 mg/kg，n=3)，對照組注射等體積無菌0.9%的氯化鈉溶液(n=3)。24 h后靜脈注射18F-SFB-Annexin B1，分別于注射后1、2、3、4 h進行PET/CT顯像。比較腫瘤/肌肉放射性攝取率比值(T/M)與原位缺口末端標記(TUNEL)染色法測定凋亡指數(shù)(AI)的關(guān)系。結(jié)果：18F-SFBAnnexin B1放化純度＞95%，生物分布顯示腎臟放射性最高，其次為肝、脾和心肌，顯像劑在體內(nèi)清除速率快?；熃M與對照組各時間點T/M比值分別為4.38±0.56、6.75±1.16、6.44±1.12、4.81±0.17和2.35±0.14、2.99±0.55、3.04±0.41、2.33±0.47，差異有統(tǒng)計學意義(F分別為23.790、16.913、14.046、77.517，P均＜0.05)。TUNEL染色AI分別為(21.00±0.04)%和(8.58±0.01)%，差異有統(tǒng)計學意義(F=21.539，P＜0.05)，且T/M值與AI間有很好的相關(guān)性(r=0.91，P＜0.05)。結(jié)論：18F-SFB-AnnexinB1能早期反映化療誘導的細胞凋亡，有望用于活體細胞凋亡分子顯像和早期療效判斷。

膜聯(lián)蛋白B1；凋亡；放射性核素顯像；化學療法；療效評價

位于細胞膜內(nèi)層的磷脂酰絲氨酸(PS)翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面是凋亡發(fā)生的特征之一，膜聯(lián)蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)是膜聯(lián)蛋白家族中的一員，具有Ca2+依賴性PS結(jié)合活性，可以反映凋亡，在監(jiān)測神經(jīng)元退行性變、心腦血管缺血-再灌注損傷、移植器官排斥反應和評價腫瘤治療療效等方面具有良好應用前景［1-7］，其中99mTc-AnnexinⅤ已進入臨床研究，用于頭頸部腫瘤、淋巴瘤、乳腺癌和肺癌等惡性腫瘤療效評價［8-10］，是目前應用最多的SPECT細胞凋亡顯像探針。

Annexin B1是膜聯(lián)蛋白家族新成員，由我國科學家孫樹漢教授等首次克隆成功［11］。99mTc-Annexin B1在小鼠胸腺、肝臟凋亡模型中均能良好地顯示凋亡，結(jié)果與原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測一致［12-13］。

本研究在18F標記Annexin B1、體外探測anti-Fas抗體誘導Jurkat細胞凋亡和體內(nèi)探測家兔腎臟缺血-再灌注損傷凋亡基礎(chǔ)上［14］，進一步探討其評價腫瘤化療后凋亡的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性昆明小鼠(n=12，20～25 g)用于生物分布實驗，雄性SD大鼠(n=6，180～200 g)用于荷瘤模型制備。所有實驗動物均購于復旦大學實驗動物科學部。

1.2 儀器和試劑

Annexin B1由上海第二軍醫(yī)大學醫(yī)學遺傳學教研室提供。醫(yī)用回旋加速器、正電子藥物合成儀和顯像設(shè)備均為德國Siemens制造，型號分別為RDS Eclipse ST、Explora GN和Biograph 16HR，γ計數(shù)器為上海核所日環(huán)光電儀器有限公司SN-695B型，TUNEL試劑盒、環(huán)磷酰胺(CTX)分別購自德國Merck和Baxter Oncology GmbH公司。

1.3 實驗方法

1.3.118F-Annexin B1標記

根據(jù)文獻［15-16］的方法制備。通過耦合劑N-琥珀酰亞胺-4-氟苯甲酸酯(N-succinimidyl-4-fluorobenzoate, SFB)將18F標記到Annexin B1上，檢測其標記率、放射化學純度和穩(wěn)定性。

1.3.2 正常小鼠體內(nèi)生物分布

昆明小鼠隨機分為4組，每組3只。尾靜脈注射0.74 MBq(0.4 mL)/只18F-SFB-Annexin B1，分別于注射后0.5、1、2、4 h取各主要臟器稱重、放射性計數(shù)，計算每克組織百分注射率(%ID/g)。

1.3.3 化療誘導腫瘤凋亡

抽取Walker-256癌肉瘤腹水種鼠淡黃色渾濁腹水，經(jīng)0.9%的氯化鈉溶液1∶1稀釋后，以1 mL/只接種于小鼠右側(cè)腋窩處皮下。待腫瘤長至直徑1 cm時，隨機分為化療組和對照組，每組各3只?；熃M小鼠腹腔注射CTX (200 mg/kg)，對照組小鼠注射等體積無菌0.9%的氯化鈉溶液，24 h后進行18F-SFB- Annexin B1 PET/CT顯像。

1.3.4 荷瘤大鼠凋亡顯像

荷瘤大鼠尾靜脈注射3.7 MBq(0.5 mL)/只18F-SFB-Annexin B1，10 min后腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉。分別于注射顯像劑后1、2、3、4 h進行PET/CT靜態(tài)顯像。1個床位/只大鼠，每個床位采集10 min，圖像分析采用感興趣區(qū)(region of interest，ROI)技術(shù)，取右側(cè)腋窩腫瘤部位和同層面對側(cè)上肢肌肉組織作為ROI，分別測量兩者最大標準攝取值(maximum standard uptake value，SUVmax)，計算腫瘤與肌肉SUVmax之比(即T/M)。

1.3.5 TUNEL檢測細胞凋亡

顯像結(jié)束后立即處死小鼠，取腫瘤組織4%甲醛溶液中固定，24 h后石蠟包埋、切片，每片厚4 μm。每個樣品取2張相鄰切片按試劑盒說明書進行TUNEL法檢測，以細胞核內(nèi)有棕黃色顆粒者為凋亡陽性細胞。每張切片隨機選取5個視野(×200)，計數(shù)凋亡細胞數(shù)占細胞總數(shù)百分比作為凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)，以AI反映各組腫瘤細胞凋亡情況。

1.3.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)均用x±s 表示，組間比較采用one-way ANOVA， T/M值與AI值作直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.118F-SFB-Annexin B1的質(zhì)量

產(chǎn)物標記率(27.8 ± 6.9)%(n=5)，放射化學純度(96.4 ± 1.3)%(n=5)，分別在小牛血清和PBS體系內(nèi)室溫放置3個半衰期(6 h)，放射化學純度仍＞90%。

2.2 正常小鼠體內(nèi)生物分布

小鼠18F-SFB-Annexin B1體內(nèi)生物分布情況(表1)。腎臟放射性最高，其次為肝臟、脾臟及心肌，2 h時上述臟器放射性攝取率均降至較低水平，顯像劑主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄。血液中放射性清除速率快，30 min時即可降至(0.198 4±0.110 0)%ID/g，其余臟器各時間點放射性攝取率變化不明顯。

2.3 荷瘤大鼠活體顯像

Walker-256癌肉瘤腹水接種成瘤率100%。兩組荷瘤大鼠尾靜脈注射18F-SFB-Annexin B1 1、2、3、4 h后的PET/CT圖像均見腫瘤顯影，內(nèi)部壞死灶因無血液供應呈放射性分布缺損(圖1)。化療組1、2、3、4 h的T/M值分別為4.38±0.56、6.75±1.16、6.44±1.12和4.81±0.17，對照組為2.35±0.14、2.99±0.55、3.04±0.41和2.33±0.47，差異有統(tǒng)計學意義(F分別為23.790、16.913、14.046、77.517，P均＜0.05)。1 h時腫瘤顯影最明顯，但軟組織本底亦較高，肝臟、脾臟、腎臟和膀胱清晰顯影，2～3 h時軟組織本底放射性逐漸清除，T/M值升高，且肝臟、脾臟放射性攝取程度明顯減低，腎臟和膀胱全程均見顯影。

圖 1 荷Walker-256癌肉瘤大鼠PET/CT凋亡顯像Fig. 1 PET/CT apoptosis imaging of Walker-256 bearing rat

表 118F-SFB-Annexin B1在正常小鼠體內(nèi)分布Tab. 1 Biodis ion of18F-SFB-Annexin B1 in normal mice

2.4 TUNEL檢測細胞凋亡

TUNEL染色觀察到化療組小鼠有大片黃染顆粒，表明存在大量凋亡細胞，對照組腫瘤亦有較多黃染顆粒，提示存在一定程度的自身凋亡(圖2)。但化療組AI為(21.00±0.04)%，對照組為(8.58±0.01)%，差異有統(tǒng)計學意義(F=21.539，P＜0.05)。表明經(jīng)CTX處理24 h后，腫瘤細胞凋亡數(shù)量明顯增加。T/M比值與AI間有很好的正相關(guān)性(r=0.91，P＜0.05)。

圖 2 腫瘤凋亡TUNEL檢測Fig. 2 TUNEL detecting

3 討 論

PS外翻發(fā)生在凋亡形態(tài)學改變之前，為早期檢測細胞凋亡提供了有效靶點。傳統(tǒng)檢測細胞凋亡的方法大都屬于有創(chuàng)檢查，且不能連續(xù)、動態(tài)監(jiān)測凋亡在活體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程，難以直觀評估療效，臨床實際應用價值有限。因此，應用現(xiàn)代影像示蹤等技術(shù)進行活體監(jiān)測凋亡已經(jīng)成為生命科學領(lǐng)域的熱點問題［17-21］，其中使用放射性核素標記膜聯(lián)蛋白的應用報道最多。

國內(nèi)外學者已經(jīng)在99mTc-AnnexinⅤ監(jiān)測細胞凋亡方面做了大量研究,取得很好的結(jié)果，并應用于多個臨床試驗中。但SPECT空間分辨率較低、產(chǎn)物體內(nèi)生物分布不理想是其未在臨床廣泛應用的重要原因。PET/CT是目前醫(yī)學影像領(lǐng)域先進的分子功能顯像技術(shù)，應用正電子核素(如18F)標記AnnexinⅤ所獲得的產(chǎn)物進行PET顯像可以明顯提高影像質(zhì)量。Murakami等［21］比較18F-SFB-AnnexinⅤ和99mTc-HYNICAnnexinⅤ在正常大鼠和心肌缺血模型大鼠體內(nèi)生物分布發(fā)現(xiàn)，凋亡心肌攝取兩種顯像劑均是正常心肌的3倍，但前者在肝、脾和腎的分布明顯低于后者。本研究中使用［18F］SFB作為標記中間體，成功制備18F-SFB-Annexin B1，產(chǎn)物具有良好的體外穩(wěn)定性和放化純度，生物分布結(jié)果顯示，18F-SFB-AnnexinB1在小鼠腎臟分布最高，其次為肝、脾和心肌，但均低于99mTc-Annexin B1［12］。因此，本研究的18F-SFBAnnexin B1可能較99mTc- AnnexinⅤ和99mTc- AnnexinB1更適合應用于臨床凋亡顯像，尤其是對腹部凋亡病灶檢測更具優(yōu)勢。此外，本研究靶/本底比值是99mTc-HYNIC-annexinⅤ檢測荷瘤鼠單次化療24h后靶/本底比值的2～3倍［22］(4.4～6.4 vs 2.1～2.5)，提示18F-SFB-Annexin B1的圖像質(zhì)量較好，凋亡誘導模型也較為理想。

放療、化療早期即可誘導腫瘤細胞凋亡，早期、無創(chuàng)、動態(tài)地觀察治療后凋亡發(fā)生情況，對腫瘤治療療效監(jiān)測、臨床個體化治療方案制定和調(diào)整、預后判斷和新藥研發(fā)等都有十分重要的意義?？紤]到化療可操作性強，本研究采用單次大劑量腹腔給予CTX作為誘導凋亡的方法，結(jié)果提示凋亡誘導較為理想，與對照組自身的凋亡現(xiàn)象存在差異。

細胞凋亡發(fā)生后會出現(xiàn)2個PS高峰，分別在1～5 h和9～24 h，僅后者與凋亡有關(guān)［7］。因此，選擇在CTX處理24 h后進行PET/CT顯像，結(jié)果化療組腫瘤攝取顯像劑程度和TUNEL檢測陽性率均高于對照組的2倍，且兩者具有良好的正相關(guān)。注射顯像劑1 h后腫瘤顯影最明顯，輪廓清晰(圖1)，但該時間點肝、脾、腎和膀胱放射性均較高，不利于對腹盆腔病灶的評估。對于腹盆腔以外病灶，該時間點T/M值較高，可作為局部療效評價較為適宜的顯像時間。隨著藥物在體內(nèi)代謝，放射性在各主要臟器逐漸清除，2 h時可見肝、脾放射性分布明顯減低，因此該時間點可以作為腹腔病灶或全身療效評價的適宜顯像時間。本研究進行了1～4 h顯像，可見膀胱在顯像全程均顯影，這可能會影響對盆腔病灶療效判斷的準確性。對此，臨床可以嘗試使用利尿藥物、導尿或者大量飲水等方法加速膀胱內(nèi)放射性尿液的排泄來配合凋亡顯像，從而提高檢出率。

有效的放化療在誘導腫瘤細胞凋亡的同時，還可誘發(fā)一定量的腫瘤細胞壞死，后者細胞膜的通透性明顯增高，繼而發(fā)生裂解，暴露于細胞基質(zhì)中的PS亦可以與膜聯(lián)蛋白結(jié)合，從而干擾凋亡顯像效果。Van De Wiele等［7］對20例頭頸部鱗癌患者進行99mTc-HYNIC-rh-annexinⅤ凋亡顯像結(jié)果證實，只有在缺乏壞死的情況下，腫瘤組織對顯像劑的攝取才與TUNEL檢測陽性率正相關(guān)。自噬是一種Ⅱ型程序性細胞死亡，是一個細胞通過溶酶體降解作用清除衰老、受損或多余的線粒體或其他細胞器的過程［23］，以出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹部分胞質(zhì)和細胞器的自噬體為特征。某些情況下，誘導自噬可以抑制腫瘤生長，并致自噬相關(guān)性細胞死亡，但大多數(shù)情況下，腫瘤細胞可利用自噬應對缺氧、營養(yǎng)匱乏，能清除氧自由基、損傷的線粒體，從而保護腫瘤細胞。因此，在凋亡顯像研究中還要注意識別細胞壞死和自噬現(xiàn)象。

本研究是在小動物PET/CT引進之前的結(jié)果，隨著本科室小動物顯像設(shè)備的應用，18FSFB- Annexin B1在凋亡檢測中的價值會得到更好的體現(xiàn)。另外，大分子蛋白在體內(nèi)的生物分布劣于小分子化合物，我們今后的研究將致力于標記Annexin B1蛋白功能片段。

綜上所述，18F-SFB- Annexin B1能夠反映化療誘導下的腫瘤細胞凋亡，有望成為臨床PET/ CT監(jiān)測細胞凋亡的分子影像探針。

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《中國癌癥雜志》舉辦繼續(xù)教育函授班通知

經(jīng)本刊編委會討論決定，本刊從2013年下半年起舉辦2014年度繼續(xù)醫(yī)學教育函授班：

一、2013年第8期起開設(shè)2014年度函授繼續(xù)醫(yī)學教育專欄，本年度的主要內(nèi)容包括：胰腺癌、食管癌、胃癌的病理診斷、放射治療及內(nèi)外科治療等。每期刊登1講，共12講，2014年第8期刊登考試試題，第9期刊登正確答案，要求學員認真閱讀講座后答題，并將答案寄至編輯部（復印無效），考卷經(jīng)專人統(tǒng)一審閱，合格者授予Ⅱ類繼續(xù)教育學分10分，學分證書由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院頒發(fā)。

二、參加對象：所有正在從事醫(yī)學專業(yè)技術(shù)工作的衛(wèi)生技術(shù)人員。預參加者請寫好本人姓名、年齡、性別、職稱、職務、學歷、選派單位名稱（地址及郵政編碼）、所在科室、聯(lián)系電話等寄往本編輯部（E-mail：zgaz@chinajournal.net.cn；zgazzz@163.com），同時通過郵局匯款（單位名稱：《中國癌癥雜志》編輯部；地址：上海市徐匯區(qū)東安路270號）的方式支付函授教育費，并請在匯款備注中注明“2014年度函授繼續(xù)教育”。編輯部收到學員報名和函授教育費后編號登記注冊，隨即寄出注冊費發(fā)票，并按時寄上每期刊物。即日起開始報名。

三、學員每人收費200元，贈送12期雜志。編輯部依據(jù)學員報名登記注冊編號、交費記錄和考試成績于2014年10月30日以前寄發(fā)學分證書。

四、編委會邀請有關(guān)專家進行出題、閱卷工作，并設(shè)專人負責。電話：021-64188274；傳真：021-64043766；郵編：200032；聯(lián)系人：王露。歡迎廣大醫(yī)務人員踴躍參加。

Experimental study on tumor response to chemotherapy with 18F-SFB-Annexin B1

ZHENG Yu-jia, WANG Ming-wei, ZHANG Jian-ping, XU Jun-yan, YANG Zhong-yi, CHENG Jing-yi, ZHANG Yongping, ZHANG Ying-jian (Department of Nuclear Medicine, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

ZHANG Ying-jian E-mail: yjzhang111@Yahoo.com.cn

Background and purpose: One of the main mechanism of chemotherapy is inducing tuomr apoptosis. Molecular imaging can allow noninvasively and dynamically monitor tumor apoptosis in vivo, and help to drug screening and therapeutic evaluation. The purpose of this study was to evaluate the feasibility of18F-SFB-Annexin B1 in detecting apoptosis at an early phase after chemotheraphy. Methods: Annexin B1 was labeled with18F using SFB as a chelating agent. Tissue distribution of18F-SFB-Annexin B1 was studied in healthy mice by the dissection method. W256 tumor-bearing rats were injected with18F-SFB-Annexin B1 intravenously at 24 h after the treatment of cyclophosphamide (CTX 200 mg/kg) or saline. Then imaging was acquired at 1, 2, 3, and 4 h postinjection on a PET/ CT, and the tumor-to-muscle ratio of SUVmax(T/M) and the AI from TUNEL testing were compared. Results:18F-SFBAnnexin B1 had a radiochemical pruity (RCP)＞95%. Biodistribution of this probe showed a predominant uptake in the kidney, then was liver, spleen, and myocardium, rapid clearance from blood and urinary was observed. The radios of T/M were 4.38±0.56, 6.75±1.16, 6.44±1.12, 4.81±0.17, respectively at 1, 2, 3, 4 h post injection of the chemotherapy group, much higher than that of the saline group (2.35±0.14, 2.99±0.55, 3.04±0.41, 2.33±0.47, respectively). The differences between the two groups were significant (F=23.790, 16.913, 14.046, 77.517, respectively, all P＜0.05). TUNEL staining revealed that chemotherapy treatment significantly increased the percentage of apoptosis cells with anAI of (21.00±0.04)% in the chemotherapy group, higher than that in the saline group (8.58±0.01)%, the difference was significant (F=21.539, P＜0.05). The radios of T/M were significantly correlated with the values of AI (r=0.91, P＜0.05). Conclusion:18F-SFB-Annexin B1 can be used to apoptosis imaging and early therapeutic evaluation in vivo because it can reflect apoptosis at an early stage after chemotheraphy.

Annexin B1; Apoptosis; Radionuclide imaging; Chemotherapy; Response evaluation

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.004

R73-36

：A

：1007-3639(2013)10-0798-06

2012-12-31

2013-07-17）

章英劍 E-mail:yjzhang111@Yahoo.com.cn