喉鱗癌患者外周血T淋巴細(xì)胞AgNORs表達(dá)與臨床相關(guān)因素的分析

門倩倩歐陽電丁衛(wèi)泉蘇旋楊安奎

1.中山大學(xué)腫瘤防治中心頭頸科，華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室，廣東 廣州 510060；

2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院耳鼻喉科，廣州 番禺 511400

喉鱗癌患者外周血T淋巴細(xì)胞AgNORs表達(dá)與臨床相關(guān)因素的分析

門倩倩1歐陽電1丁衛(wèi)泉2蘇旋1楊安奎1

1.中山大學(xué)腫瘤防治中心頭頸科，華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室，廣東 廣州 510060；

2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院耳鼻喉科，廣州 番禺 511400

背景與目的：T淋巴細(xì)胞核仁形成區(qū)嗜銀蛋白(argyrophilic nucleoar organizer regions, AgNORs)檢測已在惡性腫瘤診斷、預(yù)后判斷中得到廣泛的研究和應(yīng)用，檢測T淋巴細(xì)胞的AgNORs含量可用于反映惡性腫瘤的預(yù)后及復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)AgNORs定量分析是咽癌、多發(fā)性骨髓瘤、男性乳腺癌和前列腺癌獨立的預(yù)后因素。本研究檢測喉鱗癌患者外周血AgNORs的表達(dá)，分析其與年齡、性別、臨床分期、T分期、N分期、解剖分區(qū)、病理分級、切緣和復(fù)發(fā)等的相關(guān)性。方法：收集中山大學(xué)腫瘤防治中心頭頸科2001年2月—2004年6月初治的喉鱗癌患者的臨床資料，利用KL型圖像分析系統(tǒng)測定喉鱗癌患者外周血T淋巴細(xì)胞AgNORs的含量；統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并進(jìn)行Log-rank檢驗，因素間的相關(guān)關(guān)系采用χ2檢驗，多因素分析采用Cox模型。結(jié)果：AgNORs表達(dá)陽性組5年生存率(58%)較陰性組(76%)低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.048)。年齡、解剖分區(qū)、臨床病理分期、T分期、N分期、切緣、復(fù)發(fā)和AgNORs陽性表達(dá)是影響喉癌預(yù)后的重要因素(P＜0.05)；AgNORs陽性表達(dá)與臨床病理分期、T分期、復(fù)發(fā)和切緣相關(guān)(P＜0.05)；聲門上型喉鱗癌AgNORs陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.038)，切緣陰性患者中AgNORs陽性表達(dá)與復(fù)發(fā)相關(guān)(P=0.046)；年齡和復(fù)發(fā)是影響喉癌預(yù)后的獨立因素。結(jié)論：術(shù)后切緣陰性的喉鱗癌患者AgNORs表達(dá)陽性推薦術(shù)后行積極治療，聲門上型喉癌中AgNORs表達(dá)陽性提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大，可考慮行選擇性淋巴結(jié)清掃術(shù)。

喉鱗癌；核仁形成區(qū)嗜銀蛋白；預(yù)后

核仁組成區(qū)(nucleoar organizer regions，NORs)是一系列能被銀染法選擇性染色的嗜銀性蛋白的核仁組成成分，銀染之后，NORs呈黑色斑點，定位于細(xì)胞核仁區(qū)的特定部位，很容易被識別，稱之為核仁形成區(qū)嗜銀蛋白(argyrophilic nucleolar organizer regions，AgNORs)。AgNORs的本質(zhì)是RNA聚合酶的亞單位，是核糖體基因(rRNA)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白，目前已廣泛用于腫瘤研究。AgNORs 的含量通常用銀染核仁面積與細(xì)胞核面積的比值(I.S%)表示，用于反映細(xì)胞rRNA 轉(zhuǎn)錄活性的高低。該比值升高，rRNA轉(zhuǎn)錄活性增高；反之，表明轉(zhuǎn)錄活性降低。T淋巴細(xì)胞AgNORs代表著T淋巴細(xì)胞內(nèi)核仁形成區(qū)的DNA轉(zhuǎn)錄活性即T淋巴細(xì)胞的免疫活性，間接反應(yīng)喉癌患者的免疫狀態(tài)。本研究利用KL型圖像分析系統(tǒng)，測定了喉鱗癌患者外周血T淋巴細(xì)胞AgNORs的含量并分析其與年齡、性別、臨床病理分期、T分期、N分期、解剖分區(qū)、病理分級、切緣和復(fù)發(fā)等因素的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

2001年2月—2004年6月中山大學(xué)腫瘤防治中心頭頸科122例初治喉鱗癌手術(shù)患者作為研究對象，其中男性115例，女性7例；年齡最小32歲，最大80歲，中位年齡58歲；聲門上型喉癌 39例，聲門型喉癌83例；臨床病理分期(UICC 2002)Ⅰ+Ⅱ期為75例，Ⅲ+Ⅳ期為47例；T分期中T1+T280例，T3+T442例；N分期中N0104例，N+18例；病理分級中，G1 61例，G2 34例，G3 16例，其他11例；切緣陽性21例，陰性101例；復(fù)發(fā)36例，未復(fù)發(fā) 86例，所有患者均手術(shù)治療；無免疫系統(tǒng)疾?。恍g(shù)前未用影響機(jī)體免疫功能的藥物；無嚴(yán)重心、肝、腎和肺等重要臟器疾病；未曾接受放療、化療；無合并感染和嚴(yán)重創(chuàng)傷；隨訪資料完整。所有對照者均來自同期本院體檢的健康醫(yī)務(wù)人員，在檢查者休息好、安靜和無菌條件下，清晨抽取外周靜脈血檢測外周血T淋巴細(xì)胞，共19人，其中男性15人，女性4人，年齡最小26歲，最大69歲，中位年齡40歲。

1.2 方法

儀器為KL型圖像分析系統(tǒng)。5%硝酸銀及相應(yīng)的印染試劑和RPMI-1640培養(yǎng)液等試劑由北京健爾康公司提供。采用國際AgNORs計量委員會制定的染色和計算機(jī)輔助形態(tài)測量法進(jìn)行檢測。檢測流程：細(xì)胞培養(yǎng)→細(xì)胞分離→制片→銀染→封片→上機(jī)進(jìn)行讀片分析。計算30個T淋巴細(xì)胞核仁銀染面積與細(xì)胞核面積比值(I.S%)。具體檢測方法參見文獻(xiàn)［1］。健康人I.S%為6～10，＞10多見于急性炎性反應(yīng)，而＜6提示免疫功能低下，故業(yè)界多以I.S%=6為臨界值［2］。本研究參考數(shù)值I.S%≤6為陽性組，＞6為陰性組。本組資料中陽性組65例，陰性組57例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析；生存時間按月計算，死亡患者，生存時間為手術(shù)日至死亡之日；生存患者的生存時間為手術(shù)日至最后隨訪日(2011年12月31)。生存分析采用Kaplan-Meier法，單因素分析采用Log-rank檢驗，兩個相關(guān)因素分析采用χ2檢驗，預(yù)后分析采用Cox模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生存率分析

本組喉癌患者總的5年生存率為67%。AgNORs陽性組5年生存率為58%，陰性組為76%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.048，圖1)。

圖 1 AgNORs表達(dá)陽性組和陰性組生存曲線的比較Fig. 1 Comparison of survival curves in 122 laryngeal squamous cell carcinoma

2.2 AgNORs表達(dá)情況分析

AgNORs在喉癌患者和健康人中的表達(dá)陽性率分別為53.3%和26.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029，表1，圖2、3)。AgNORs陽性表達(dá)與臨床病理分期、T分期、復(fù)發(fā)和切緣相關(guān)(P＜0.05)，與性別、年齡、解剖分區(qū)、N分期和病理分級無關(guān)(P＞0.05，表2)。

表 1 AgNORs在健康人及喉癌患者中的表達(dá)Tab. 1 AgNORs expression in healthy people and laryngeal carcinoma patients

在分層分析中，39例聲門上型喉鱗癌患者有14例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中6例AgNORs表達(dá)陽性，表達(dá)陽性率為42.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038)，并且AgNORs表達(dá)與聲門上型喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(r=0.331)。在101例切緣陰性患者中，復(fù)發(fā)26例，未復(fù)發(fā)75例；AgNORs表達(dá)陽性者49例，陰性者52例，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，AgNORs 表達(dá)在切緣陰性患者復(fù)發(fā)方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.046，表2)。

圖 2 喉癌患者T淋巴細(xì)胞中AgNORs陽性表達(dá)Fig. 2 AgNORs positive expression in laryngeal carcinoma patients

圖3 喉癌患者T淋巴細(xì)胞中AgNORs陰性表達(dá)Fig.3 AgNORs negative expression in laryngeal carcinoma patients

表 2 AgNORs表達(dá)與臨床相關(guān)因素分析Tab. 2 The relationship between AgNORs expression and clinical factors in laryngeal carcinoma patients

2.3 單因素分析結(jié)果

單因素分析結(jié)果顯示，年齡、解剖分區(qū)、臨床病理分期、T分期、N分期和復(fù)發(fā)是影響喉癌預(yù)后的重要因素(表3)。

2.4 Cox多因素分析結(jié)果

將通過單因素分析篩選出的有意義的影響因素(年齡、解剖分區(qū)、臨床病理分期、T分期、N分期、切緣、復(fù)發(fā)和AgNORs表達(dá))進(jìn)入Cox回歸模型，前進(jìn)法分析，經(jīng)檢驗發(fā)現(xiàn)：模型總體有意義，其中年齡和復(fù)發(fā)是影響喉癌預(yù)后的獨立因素(表4)。

表 3 122例喉鱗癌患者單因素分析Tab.3 Univariate survival analysis results of 122 patients with laryngeal squamous cell carcinoma

表 4 喉鱗癌患者預(yù)后多因素分析結(jié)果Tab. 4 Result of Cox regression model for analysis of patients with laryngeal squamous cell carcinoma

3 討 論

惡性腫瘤多發(fā)生在機(jī)體免疫功能低下或相對低下時，而惡性腫瘤發(fā)生后，又可釋放免疫抑制因子，造成機(jī)體免疫力進(jìn)一步降低，使腫瘤得以迅速發(fā)展。T淋巴細(xì)胞不僅是機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要免疫活性細(xì)胞，也是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。近年來，T淋巴細(xì)胞AgNORs檢測已在惡性腫瘤診斷、預(yù)后判斷中得到廣泛的研究和應(yīng)用。林其燧等［3］應(yīng)用腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)檢測了100例惡性腫瘤外周血T 淋巴細(xì)胞AgNORs表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除惡性腫瘤以外的患者其I.S%均值為13.99%，健康人I.S%均值為6～10，惡性腫瘤患者的I.S%均值＜6。惡性腫瘤患者I.S%值明顯低于健康人及非腫瘤患者，表明外周血T淋巴細(xì)胞AgNORs表達(dá)水平對惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷有意義。因T淋巴細(xì)胞AgNORs在惡性腫瘤患者為低表達(dá)，所以檢測T淋巴細(xì)胞的AgNORs含量可用于反映惡性腫瘤的預(yù)后及復(fù)發(fā)。國內(nèi)外不少學(xué)者將AgNORs用于腫瘤研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展時T淋巴細(xì)胞AgNORs含量下降，腫瘤得到控制時T淋巴細(xì)胞AgNORs含量上升［3-4］。

AgNORs可用于全身惡性腫瘤患者的預(yù)后觀察和復(fù)發(fā)風(fēng)險預(yù)測，陳巧倫等［1］對鼻咽癌患者AgNORs進(jìn)行了分析，揭示AgNORs含量變化對預(yù)后的觀察有一定的意義。Pich等［5］報道分裂間期的AgNORs定量分析是咽癌、多發(fā)性骨髓瘤、男性乳腺癌和前列腺癌獨立的預(yù)后因素。國內(nèi)文獻(xiàn)報道，AgNORs計數(shù)對喉良惡性腫瘤的鑒別、檢測癌前病變及觀察腫瘤生物學(xué)行為均有意義［6-8］。進(jìn)而熊新高等［9］認(rèn)為AgNORs不僅能用于喉部腫瘤的鑒別，也可用于喉癌預(yù)后的預(yù)測。

AgNORs表達(dá)與年齡、性別的關(guān)系：本組資料中年齡≤60歲與＞60歲的患者5年生存率分別為81%和61%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)，但是AgNORs表達(dá)與年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.136)。單因素分析結(jié)果顯示，AgNORs表達(dá)與性別無關(guān)，與Shvero等［10］及國內(nèi)部分文獻(xiàn)報道相符［11-13］。

AgNORs表達(dá)與喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系：Cappiello等［14］分析喉癌資料中，AgNORs表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無關(guān)。Yamamoto等［15］認(rèn)為，AgNORs表達(dá)在預(yù)測聲門上型喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面有一定的臨床價值。在本組資料中，喉鱗癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約為14.8%(18/122)。喉癌轉(zhuǎn)移患者中AgNORs表達(dá)陽性率(55.6%)與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(52.9%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.834)。但在39例聲門上型喉鱗癌中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者AgNORs表達(dá)陽性率(42.9%)與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(76.0%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038)。表明AgNORs表達(dá)與聲門上型喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(r=0.331)，因此，對于聲門上型喉癌，若AgNORs 表達(dá)陽性說明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大，建議行選擇性淋巴結(jié)清掃術(shù)。

AgNORs表達(dá)與臨床病理分期、病理分級和解剖分區(qū)的關(guān)系：Bockmuhl等［16］和Xie等［17］在研究喉鱗癌中發(fā)現(xiàn)，AgNORs染色與腫瘤分期相關(guān)。在本組資料中，臨床Ⅲ+Ⅳ期喉癌患者AgNORs表達(dá)陽性率(68.0%)高于Ⅰ+Ⅱ期患者(44.0%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)，且AgNORs 表達(dá)與臨床病理分期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.235)。AgNORs表達(dá)在喉癌患者T1+T2及T3+T4中，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。但在病理分級G1、G2、G3中，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.555)，與Yamamoto等［15］及Hirsch等［18］的研究報道一致。在聲門上型喉癌AgNORs 表達(dá)陽性率(64.1%)較聲門型(48.2%)高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.100)，說明AgNORs 表達(dá)與腫瘤本身的分化程度及腫瘤部位無關(guān)。

AgNORs表達(dá)與復(fù)發(fā)和切緣的關(guān)系：研究發(fā)現(xiàn)AgNORs表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，Komeyev等［19］對62例膀胱癌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，AgNORs表達(dá)提示高度惡性，并對膀胱癌局部復(fù)發(fā)有一定的預(yù)測價值。本組資料中，喉癌復(fù)發(fā)率為29.5%，復(fù)發(fā)者AgNORs表達(dá)陽性率(72.2%)明顯高于未復(fù)發(fā)者(45.3%)，表明AgNORs陽性表達(dá)者易發(fā)生復(fù)發(fā)，因此對AgNORs表達(dá)陽性的患者進(jìn)行密切隨訪和適當(dāng)?shù)妮o助治療是有意義的。本組資料顯示切緣陽性患者5年累積生存率(52%)明顯低于切緣陰性者(77%)，兩組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014)。AgNORs 表達(dá)在切緣陽性者中表達(dá)陽性率(76.2%)也明顯高于切緣陰性者(48.5%)。田文棟等［20］認(rèn)為只有腫瘤殘留和切緣陽性才有必要放療，其他病例不必術(shù)后放療。但是本組資料進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在切緣陰性患者中，AgNORs陽性表達(dá)在切緣陰性患者更易復(fù)發(fā)(P=0.046)。因此，我們認(rèn)為除了術(shù)后切緣陽性的患者行放療外，對于術(shù)后切緣陰性及AgNORs表達(dá)陽性的患者應(yīng)考慮進(jìn)行積極的治療，預(yù)防復(fù)發(fā)。

在本組資料，將8個因素(年齡、解剖分區(qū)、臨床病理分期、T分期、N分期、切緣、復(fù)發(fā)和AgNORs表達(dá))納入Cox回歸模型，經(jīng)檢驗發(fā)現(xiàn)模型總體有意義，其中年齡和復(fù)發(fā)是影響喉癌預(yù)后的獨立因素，而AgNORs表達(dá)不是影響喉癌預(yù)后的獨立因素。國外多項研究發(fā)現(xiàn)AgNORs表達(dá)與喉癌預(yù)后無相關(guān)性［21-24］。Pich等［25］研究結(jié)果顯示，增殖細(xì)胞核抗原作為鼻咽癌獨立的預(yù)后因素(χ2=13.56，P＜0.001，r=8.16)，當(dāng)增殖細(xì)胞核抗原排除后，AgNORs表達(dá)對鼻咽癌預(yù)后有部分意義。Pich等［26］報道，在膀胱癌及喉咽癌中AgNORs與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)呈正相關(guān)，其不僅在增殖細(xì)胞中檢測到，而且在G0期細(xì)胞中也可檢測到。因此，AgNORs表達(dá)可能在預(yù)測喉癌預(yù)后方面還與細(xì)胞的增殖活性及檢測的細(xì)胞周期有關(guān)。

總之，聲門上型喉癌中AgNORs表達(dá)可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，AgNORs表達(dá)陽性提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大，應(yīng)考慮行選擇性淋巴結(jié)清掃術(shù)；對于術(shù)后切緣陰性及AgNORs表達(dá)陽性者建議行積極治療，以預(yù)防復(fù)發(fā)。AgNORs計數(shù)方法相對簡單、價格低廉，對喉癌的診斷、治療及預(yù)后方面有一定的臨床參考意義。

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《抗癌》雜志2013年征訂啟事

《抗癌》雜志于1988年創(chuàng)刊，主管單位為上海市科學(xué)技術(shù)協(xié)會，主辦單位為上海市抗癌協(xié)會?！犊拱冯s志是供癌癥患者及其家屬閱讀的公益性科普期刊，樹立了為科研服務(wù)的思想意識，堅持以讀者為導(dǎo)向，架起讀者和醫(yī)院之間的橋梁。雜志刊號：CN31-1664/R ISSN 1008-3065。歡迎廣大讀者訂閱。

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Argyrophilic nucleolar organizer regions expression in laryngeal squamous cell carcinoma and its relationship with clinical factors

MEN Qian-qian, OUYANG Dian, DING Wei-quan, SU Xuan, YANG An-kui (1.Department of Head and Neck Surgery, Cancer Center, Sun Yat-sen University, State Key Laboratory of Oncology in Southern China, Guangzhou Guangdong 510060, China; 2.Department of Otorhinolaryngology, Guangzhou Panyu Central Hospital, Guangzhou Guangdong 511400, China)

YANG An-kui E-mail: yangak@sysucc.org.cn

Background and purpose: Argyrophilic nucleoar organizer regions (AgNORs) has been widely used in diagnosis and prognostic in malignant tumor, AgNORs content can be used to reflect prognosis and recurrence of the malignant tumors. Studies found that AgNORs is an independent prognostic factor in pharynx cancer, multiple myeloma, male breast cancer and prostate cancer. This study aimed to examine the expression of AgNORs in laryngeal squamous cell carcinoma and analyze the relationship between the expression of AgNORs and clinical factors including age, gender, clinical stage, T stage, N stage, classification, histology grade, recurrence and incisal edge. Methods: Clinical information and the AgNORs count of 122 cases laryngeal squamous cell carcinoma patients, who were initially treated by surgery between 2001 and 2004, were collected. SPSS 16.0 software was used. Kaplan-Meier method was used for survival analysis, and log-rank test was used for data analysis; multivariate analysis was carried out using Cox proportional hazard model. Results: The positive AgNORs expression group (5-year overall survival rate: 58%) had a worse prognosis than that of negative group (5-year overall survival rate: 76%) (P＜0.05). Age, clinicalstage, T stage, N stage, classification, recurrence, incisal edge and AgNORs expression were the most important prognostic factors (P＜0.05). The expression of AgNORs was correlated with clinical stage, T stage, recurrence and incisal edge (P＜0.05). AgNORs expression was statistically significant differences on judging lymph node metastasis in the supraglottic laryngeal carcinoma, and it was related with recurrence in the patients of negative incisal edge. Age and recurrence were independent prognosis factors on survival in laryngeal squamous cell carcinoma patients. Conclusion: Postoperative active treatment may should be recommended for cases with AgNORs positively expressed and the incisal edge negative; and selective lymph node dissections may should be performed on supraglottic laryngeal squamous cell carcinoma with AgNORs positive patients.

Laryngeal squamous cell carcinoma; Argyrophilic nucleoar organizer regions; AgNORs

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.05.003

R739.65

：A

：1007-3639(2013)05-0334-07

2013-01-17

2013-04-20）

廣東省科技計劃項目(No：2010B031600237)。

楊安奎 E-mail:yangak@sysucc.org.cn