RNAi沉默HIF-1α基因調(diào)控乏氧肺腺癌A549細(xì)胞放射敏感性和自噬能力

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢 430030

RNAi沉默HIF-1α基因調(diào)控乏氧肺腺癌A549細(xì)胞放射敏感性和自噬能力

鄒燕梅 熊華 肖志平 于世英 袁響林

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢 430030

背景與目的：乏氧導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞放射敏感性下降是引起腫瘤放療抵抗、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。HIF-1α基因在乏氧調(diào)控中起關(guān)鍵作用，但HIF-1α基因在乏氧肺腺癌放射敏感性中的作用及其與自噬的關(guān)系尚未闡明。本研究建立利用RNAi沉默HIF-1α基因的乏氧肺腺癌A549細(xì)胞模型，以此探討HIF-1α對乏氧細(xì)胞放射敏感性和自噬的影響。方法：構(gòu)建靶向抑制HIF-1α的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染乏氧A549細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)的克隆細(xì)胞，將其命名為A549/HIF-1α-shRNA，同時設(shè)陰性對照A549/Neg-shRNA?？寺⌒纬蓪嶒灆z測細(xì)胞D0、SF2、SER等值。Western-blot檢測細(xì)胞照射前后HIF-1α、LC3、c-parp蛋白的表達(dá)。結(jié)果：乏氧A549細(xì)胞的SF2為0.62，高于常氧A549細(xì)胞，SER為1.45；乏氧A549細(xì)胞照射后LC3Ⅱ增加，c-parp下調(diào)。乏氧A549細(xì)胞HIF-1α表達(dá)增加；A549/HIF-1α-shRNA細(xì)胞HIF-1α表達(dá)降低；A549/HIF-1α-shRNA細(xì)胞的SF2為0.45，SER為0.72，低于A549/ Neg-shRNA細(xì)胞；A549/HIF-1α-shRNA 細(xì)胞照射后LC3Ⅱ降低，c-parp上調(diào)。結(jié)論：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及RNAi技術(shù)建立的HIF-1α表達(dá)抑制克隆可以成為簡單實用的細(xì)胞模型；shRNA抑制HIF-1α的表達(dá)可提高乏氧A549細(xì)胞的放射敏感性，降低自噬活性。

乏氧；自噬；放射敏感性；HIF-1α；RNAi

由于腫瘤細(xì)胞增殖速度快，氧耗多，腫瘤內(nèi)血管結(jié)構(gòu)和功能異常，腫瘤細(xì)胞血供和氧供少，使大多數(shù)體積＞l mm3的實體腫瘤都含有相當(dāng)數(shù)量的乏氧腫瘤細(xì)胞［1-2］。臨床上很多肺癌患者對放射治療不敏感，其中很重要的原因就是乏氧［3-4］。乏氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對放療抵抗［5］，HIF-1α在其中起著極為重要的調(diào)控作用，抑制HIF-1α的表達(dá)可提高放射治療的敏感性［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)放療、乏氧等均可誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，通過自噬對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解和循環(huán)再利用，對放射線、低氧等應(yīng)激做出適應(yīng)性反應(yīng)；或通過隔離線粒體避免促凋亡因子擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)，幫助細(xì)胞逃逸凋亡［7-8］。前期研究發(fā)現(xiàn)，乏氧誘導(dǎo)自噬與放療抵抗相關(guān)。目前關(guān)于HIF-1α的研究主要集中在乏氧和放射敏感性方面，而在自噬方面則較少，為深入研究乏氧、HIF-1α、放射敏感性與自噬的關(guān)系，擬建立一個HIF-1α表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型。RNA干擾(RNA interference, RNAi) 是在小發(fā)夾RNA (small hairpin RNA, shRNA) 的介導(dǎo)下特異性降解相應(yīng)序列mRNA 的現(xiàn)象［9］。本實驗利用RNAi技術(shù)構(gòu)建靶向抑制HIF-1α mRNA的shRNA表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乏氧人肺腺癌細(xì)胞株A549，獲得HIF-1α表達(dá)抑制的乏氧細(xì)胞模型，并對該細(xì)胞的放射敏感性和自噬活性進(jìn)行初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肺腺癌細(xì)胞株A549購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科實驗室提供并傳代保存。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Gibco 公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胰蛋白消化酶、二甲基亞砜購自Sigma公司；BCA蛋白測定試劑盒、M-PERTM哺乳動物蛋白提取液購自Pierce公司；HIF-1α小鼠抗人單克隆抗體購自NeoMarkers公司；LC3、c-parp兔抗人單克隆抗體、小鼠抗人actin單克隆抗體、羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、ECL顯色試劑盒購自Santa Cruz公司。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司；含有U6啟動子的質(zhì)粒pGenesil-1購自武漢晶賽公司；限制性內(nèi)切酶HandⅢ、BamHⅠ購自Takara公司；G418購自Promega公司。

1.1.3 HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒

質(zhì)粒載體pGenesil-1是轉(zhuǎn)錄靶向抑制HIF-1α mRNA的表達(dá)質(zhì)粒，是pEGFP-C1質(zhì)粒經(jīng)Sal-I酶切插入人U6啟動子改造而成。正反義鏈由武漢晶賽生工合成(序列號 04112202)，與pGenesil-1經(jīng)HandⅢ和BamHⅠ雙酶切、T4DNA連接酶作用后形成重組質(zhì)粒HIF-1αshRNA。該重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)。正義鏈(下劃線部分為靶向抑制HIF-1α序列，19nt)：5'-GATCCGUTGTGAGTTCGCATTCTTGAUTT TCAAGACGATCAAGATGCGAACTCACATTT TTTGTCGACA-3’；反義鏈：5'-GCACACT CAAGCGTAAGAACTAAAGTTCTGCTAGTTCT ACGCTTGAGTAAAAAACAGCTGTTCGA-3'。陰性對照Neg-shRNA的靶序列為隨機(jī)序列：5'-AAGCTTCATAAGGCGCATAGC-3'，此序列不與任何人類基因序列同源。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞置于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。常氧培養(yǎng)：37 ℃、CO2和O2體積分?jǐn)?shù)為5%和20%的飽和濕度條件下培養(yǎng)。乏氧培養(yǎng)：將DY-2型培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)罐用75%酒精消毒后，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)罐中密閉，然后緩慢抽成真空，充入O2體積分?jǐn)?shù)為l%、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和N2體積分?jǐn)?shù)為94%的混合氣體，約在1 h內(nèi)平衡至O2體積分?jǐn)?shù)為l%濃度。將乏氧起始時間定為0，分別收集乏氧12、24、48 h細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞照射

將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于6孔板，以1×105個細(xì)胞/孔接種，常氧或乏氧培養(yǎng)，貼壁生長至70%～80%融合后進(jìn)行照射。照射采用直線加速器Elekta 6 MV X線，單次吸收劑量4 Gy，劑量率300 cGy/min，源皮距100 cm。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒

乏氧培養(yǎng)A549細(xì)胞，用胰蛋白消化酶消化細(xì)胞，以3×105個細(xì)胞/孔接種于6 cm培養(yǎng)皿，加入胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液4 mL溫育細(xì)胞24 h，貼壁生長至70%～80%后，用LipofectamineTM2000 介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，熒光鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后48 h以1×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板，G418篩選陽性克隆。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)10～12 d后，將G418濃度改為400 μg/mL，繼續(xù)乏氧培養(yǎng)至克隆肉眼可見后，熒光鏡下觀察標(biāo)記含GFP的克隆，挑出克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)染了HIF-1α-shRNA/ pGenesil-1和pNeg-shRNA的乏氧A549細(xì)胞分別命名為A549/HIF-1α-shRNA和A549/NegshRNA。

1.2.4 克隆形成實驗檢測SF2等值

將A549、A549/HIF-1α-shRNA、A549/ Neg-shRNA細(xì)胞用胰蛋白消化酶消化成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，稀釋，接種，加入DMEM培養(yǎng)基4～5 mL，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱，于37 ℃靜置培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后分別給予0、2、4、6、8 Gy單次吸收劑量照射(直線加速器Elekta 6 MV X線，劑量率300 cGy/min，源皮距100 cm)；照射后于37 ℃常氧或乏氧條件下培養(yǎng)12～14 d，移棄培養(yǎng)液，PBS漂洗，醋酸甲醇固定，結(jié)晶紫液染色，低倍顯微鏡下計數(shù)大于或等于50個細(xì)胞的克隆數(shù)；計算存活分?jǐn)?shù)(SF)=照射后細(xì)胞形成的克隆數(shù)/(接種細(xì)胞數(shù)×細(xì)胞種植率)；根據(jù)單擊多靶模型SF=1-(1-exp(-D0/D))N擬合細(xì)胞存活曲線，計算D0、N、Dq及SF2；計算放射增益比(SER): 乏氧條件下D0與常氧條件下D0的比值。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測HIF-1α、LC3、c-parp蛋白的表達(dá)

PBS將各種細(xì)胞洗2遍，M-PERTM哺乳動物蛋白提取液提取蛋白，測定蛋白濃度。每孔加50 μg總蛋白，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，用含50 g/L的脫脂奶粉的T-BST，37 ℃，封閉1～2 h；加入一抗，4 ℃，溫育過夜；T-BST漂洗10 min，4次；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(羊抗兔1∶2 000)，37 ℃，溫育1 h；T-BST漂洗10 min，4次；ECL顯色試劑盒曝光底片，曝光后底片上蛋白條帶用Image pro-plus Kodak軟件分析量化吸光度，以actin蛋白的含量作為參照，分別分析HIF-1α、LC3、c-parp蛋白的表達(dá)。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乏氧A549 細(xì)胞放射敏感性的變化

線性二次方程擬合生存曲線顯示常氧A549和乏氧A549細(xì)胞受照射后的生存率(圖1)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，乏氧A549細(xì)胞Dq、D0、N、SF2值分別為1.34、1.81、2.95、0.62，而常氧分別為0.61、1.25、2.04、0.43，SER值為1.45。

2.2 乏氧A549 細(xì)胞照射后凋亡和自噬的變化

Western blot結(jié)果顯示，常氧下HIF-1a蛋白低表達(dá)，乏氧下高表達(dá)。未接受照射的常氧或乏氧A549細(xì)胞無c-parp蛋白的表達(dá)，接受照射后有c-parp蛋白的表達(dá)，但乏氧A549細(xì)胞c-parp蛋白的表達(dá)低于常氧A549細(xì)胞。常氧A549細(xì)胞LC3Ⅱ蛋白表達(dá)很低，乏氧A549細(xì)胞LC3Ⅱ蛋白表達(dá)增加，乏氧A549細(xì)胞接受照射后LC3Ⅱ蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加(圖2)。

圖 1 線性二次方程擬合生存曲線顯示常氧(20%O2)A549和乏氧(1%O2)A549細(xì)胞的生存率Fig. 1 Survival fraction of normoxic and hypoxic A549 cells

圖 2 常氧或乏氧A549細(xì)胞接受照射后HIF-1α、c-parp、LC3的表達(dá)Fig. 2 The expression of HIF-1α and c-parp and LC3 of normoxic and hypoxic A549 cells with radiation RT: Radiation.

2.3 乏氧A549細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，在常氧下HIF-1α蛋白低表達(dá)，乏氧12、24、48 h時間點(diǎn)HIF-1α蛋白表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖 3 常氧或乏氧不同時間下A549細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)Fig. 3 The expression of HIF-1α of normoxic and hypoxic A549 cells

2.4 轉(zhuǎn)染HIF-1α-shRNA質(zhì)粒的細(xì)胞篩選和鑒定

選取乏氧24 h A549細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，結(jié)果觀察到了陽性克隆細(xì)胞上的綠色熒光蛋白的表達(dá)，即A549/HIF-1α-shRNA細(xì)胞(圖4)。對A549/HIF-1α-shRNA細(xì)胞進(jìn)行western blot檢測，結(jié)果與A549/Neg-shRNA相比，A549/HIF-1α-shRNA細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)明顯受抑制(圖5)。

2.5 shRNA抑制乏氧A549細(xì)胞HIF-1α表達(dá)對放射敏感性的影響

擬合生存曲線顯示，乏氧A549、A549/HIF-1a-shRNA、A549/Neg-shRNA細(xì)胞受照射后的生存率(圖6)。A549/Neg-shRNA細(xì)胞的Dq、D0、N、SF2值分別為1.21、1.68、2.77、0.59，與A549細(xì)胞結(jié)果類似。A549/HIF-1α-shRNA的Dq、D0、N、SF2值分別為0.67、1.31、2.05、0.45，均低于陰性對照A549/Neg-shRNA細(xì)胞，SER為0.72。

圖 4 轉(zhuǎn)染HIF-1α-shRNA質(zhì)粒的A549細(xì)胞熒光表達(dá)Fig.4 Fluorescence expression of A549 cells transfected with HIF-1α-shRNA(×200)

圖 5 A549/HIF-1α-shRNA細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)Fig. 5 The expression of HIF-1α of A549/HIF-1α-shRNA cells

2.6 抑制HIF-1α表達(dá)對乏氧A549細(xì)胞自噬和凋亡的影響

Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照A549/ Neg-shRNA細(xì)胞相比，乏氧條件下HIF-1α的表達(dá)被抑制后LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)降低，c-parp蛋白的表達(dá)上調(diào)(圖7)。

圖 6 乏氧A549、A549/HIF-1α-shRNA、A549/Neg-shRNA細(xì)胞的生存率Fig. 6 Survival fraction of hypoxic A549 and A549/HIF-1α-

3 討 論

圖 7 抑制HIF-1α表達(dá)后乏氧A549細(xì)胞LC3、c-parp蛋白表達(dá)Fig. 7 The expression of LC3 and c-parp of hypoxic A549/HIF-1α-shRNA

乏氧是導(dǎo)致腫瘤對放射抵抗的因素之一［10-11］。本研究通過克隆形成實驗、擬合生存曲線得出乏氧A549細(xì)胞照射后的生存率、SF2值明顯高于常氧A549細(xì)胞，從多個角度、多個證據(jù)證實乏氧確實導(dǎo)致人肺腺癌A549細(xì)胞放射敏感性下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在這個過程中，乏氧調(diào)控蛋白HIF-1α表達(dá)上調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白c-parp表達(dá)降低，而自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)上調(diào)，由此推測乏氧導(dǎo)致放射敏感性下降的原因可能與細(xì)胞逃逸凋亡和(或)誘導(dǎo)自噬相關(guān)。凋亡作為I型程序性死亡其與放射敏感性的相關(guān)性已經(jīng)有許多學(xué)者進(jìn)行了深入研究［12］。但自噬作為Ⅱ型程序性死亡與放射敏感性、乏氧及HIF-1α的復(fù)雜關(guān)系尚未得到清晰闡述。

研究發(fā)現(xiàn)乏氧可誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，自噬在腫瘤的乏氧區(qū)域表現(xiàn)明顯［13-14］。自噬是一種防御機(jī)制，在營養(yǎng)缺乏、損傷、放療等應(yīng)激情況下，特別是缺氧條件下能夠降解自身物質(zhì)獲得生存的能量，使細(xì)胞逃逸凋亡。研究顯示，腫瘤細(xì)胞的放療抗性與自噬密切相關(guān)［15］。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，乏氧誘導(dǎo)自噬與放療抵抗相關(guān)［16］。自噬活性與LC3Ⅱ表達(dá)強(qiáng)度密切相關(guān)，通過檢測LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)，可了解腫瘤細(xì)胞的自噬活性［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)乏氧可以誘導(dǎo)LC3I向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)變，尤其是乏氧A549細(xì)胞照射后表現(xiàn)更為明顯，說明乏氧可誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，自噬可能是乏氧導(dǎo)致放療抵抗的重要機(jī)理之一。

在細(xì)胞乏氧調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，HIF-1α是細(xì)胞乏氧狀態(tài)下調(diào)控基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，以其為核心，與其上下游基因及產(chǎn)物形成一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)HIF-1α在常氧下基本上不表達(dá)，一旦氧分壓降低，其表達(dá)明顯增加，提示HIF-1α的表達(dá)與氧分壓密切相關(guān)，這與文獻(xiàn)報道完全一致［19］。為進(jìn)一步深入探討其功能，擬建立HIF-1α表達(dá)受抑制的乏氧細(xì)胞模型。本研究采用的質(zhì)粒pGenesil-1為轉(zhuǎn)錄靶向抑制HIF-1α mRNA的表達(dá)質(zhì)粒，為pEGFP-C1質(zhì)粒經(jīng)Sal-I酶切插入人U6啟動子改造而成。利用RNAi及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)篩選得到的陽性克隆A549/HIF-1α-shRNA細(xì)胞，具有綠色熒光蛋白的表達(dá)，經(jīng)Western blot檢測到乏氧誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白表達(dá)幾乎完全被抑制，與預(yù)期結(jié)果一致。在成功構(gòu)建靶向抑制HIF-1α表達(dá)的乏氧細(xì)胞模型后，采用克隆形成實驗檢測細(xì)胞的放射敏感性，結(jié)果顯示shRNA抑制HIF-1α表達(dá)可提高乏氧A549細(xì)胞的放射敏感性，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞放射抵抗。這給我們在臨床研究中提供了一個思路，抑制HIF-1α可能可以作為提高放療療效的另一靶點(diǎn)。

我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)乏氧條件下細(xì)胞放射敏感性降低，細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，且均與HIF-1a的表達(dá)相關(guān)［16］。文獻(xiàn)報道，乏氧細(xì)胞通過上調(diào)HIF-1，調(diào)控下游目的分子 BNIP3和BNIP3L的表達(dá)，BNIP3通過與其他分子之間的相互作用誘導(dǎo)自噬，保護(hù)自身免受乏氧造成的損傷［20］；或乏氧細(xì)胞通過HIF-1α/AMPK通路誘導(dǎo)自噬［21］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)乏氧條件下HIF-1α表達(dá)受抑制后 LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)明顯降低，c-parp表達(dá)量增加。乏氧可能是通過上調(diào) HIF-1α，激活 HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)LC3Ⅱ的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)。而HIF-1α 被抑制后，細(xì)胞可能出現(xiàn)程序性死亡即凋亡，這與細(xì)胞放射敏感性增高相吻合。由此我們認(rèn)為抑制HIF-1的表達(dá)后，自噬的這種保護(hù)作用下降，細(xì)胞凋亡增加，從而提高細(xì)胞的放射敏感性。

本研究運(yùn)用RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了靶向抑制HIF-1α表達(dá)的乏氧細(xì)胞模型，相對比較簡便，并可用于其他細(xì)胞模型進(jìn)行相關(guān)研究。利用shRNA抑制HIF-1α表達(dá)后提高乏氧A549細(xì)胞的放射敏感性，降低自噬活性，說明自噬在乏氧所致的放射抵抗中占有重要作用，并且HIF-1α在其中起到關(guān)鍵介導(dǎo)作用，但具體機(jī)制還需要深入研究。

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《抗癌》雜志征稿啟事

《抗癌》雜志于1988年創(chuàng)刊，主管單位為上海市科學(xué)技術(shù)協(xié)會，主辦單位為上海市抗癌協(xié)會，雜志刊號：CN31-1664/R ISSN 1008-3065。征稿欄目及內(nèi)容如下。

一、《抗癌博客》欄目

記錄癌癥患者自強(qiáng)不息、熱愛生活、勇敢面對病痛和生活壓力的故事，能夠啟發(fā)其他患者自信和勇敢的精神，幫助他們建立積極、知足、感恩和達(dá)觀的生活態(tài)度。可以是你的親身經(jīng)歷，也可以是醫(yī)生治療患者時的所見所聞，或是你身邊發(fā)生的故事。

二、《正誼明道、大醫(yī)精誠》欄目

真實記錄醫(yī)生對患者的關(guān)懷；或是愛崗敬業(yè)、精益求精富有專業(yè)精神的事跡，能讓更多醫(yī)道同仁敬重和學(xué)習(xí)?？梢灾v述患者眼里的醫(yī)生，也可以記錄你的同事。

以上稿件《抗癌》雜志編輯部在發(fā)表時有修改的權(quán)力，如果不同意修改請注明，謝謝！歡迎各位作者踴躍投稿。

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Effect of HIF-1α expression inhibition by RNA interference on radiosensitivity and autophagy of hypoxic human lung adenocarcinoma cell line A549

ZOU Yan-mei, XIONG Hua, XIAO Zhi-ping, YU Shi-ying, YUAN Xiang-lin (Cancer Center, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Hubei, 430030, China)

XIONG Hua E-mail: xionghua2001@yahoo.com.cn

Background and purpose: Hypoxia induced the decreased radiosensitivity of tumor cells, which was the cause of tumor radioresistance and relapse and metastasis. During the course, HIF-1a played the most important role in the regulation of hypoxia. However, it’s still unknown about the effect of HIF-1a on the radiosensitivity of hypoxia tumor cells and the relationship with autophagy. This study was to inhibit HIF-1α expression in hypoxic lung adenocarcinoma cell line A549 with RNA interference (RNAi), and explore its effect on hypoxic cell radiosensitivity and autophagy. Methods: Plasmids pHIF-1α-shRNA and Neg-shRNA (negative control) were constructed and transfected into hypoxic A549 cells, this positive clone was named A549/HIF-1α-shRNA. Clone formation array was applied to calculate the value of D0, SF2, SER. The expression of HIF-1α, LC3, c-parp was detected by Western blot. Results: The SF2 of hypoxic A549 cell was 0.62, which was higher than that of normoxic A549 cell, SER was 1.45. The level of LC3Ⅱ increased significantly and the level of c-parp decreased after the radiation of hypoxic A549 cell. The level of HIF-1a increased in hypoxic A549 cells. The expression of HIF-1α in hypoxic A549 cells was suppressed markedly after transfection of HIF-1α-shRNA; this clone was named A549/HIF-1α-shRNA. The SF2 and SER were significantly lower in A549/HIF-1α-shRNA cells, 0.45 and 0.72 respectively. Under the hypoxic condition and after the inhibition of HIF-1α, the expression of LC3Ⅱ decreased significantly and the expression of c-parp increased. Conclusion: We successfully established a cell model that HIF-1α expression was suppressed almost completely byRNAi. The inhibition of HIF-1α by shRNA may raise the radiosensitivity and decrease the autophagy of hypoxic A549 cells in vitro.

Hypoxia; Autophagy; Radiosensitivity; HIF-1α; RNAi

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.06.003

R734.2

：A

：1007-3639(2013)06-0413-07

2013-02-22

2013-04-03）

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(No：81201779)。

熊華 E-mail:xionghua2001@yahoo.com.cn