過度訓練對大鼠骨骼肌糖代謝的影響

劉無逸， 錢 鶴， 王 磊， 李 海

（1.上海體育學院運動科學學院，上海200438；2.阿迪達斯體育（中國）有限公司，北京100022；3.四川內江師范學院體育學院，四川內江641000）

過度訓練對大鼠骨骼肌糖代謝的影響

劉無逸1， 錢 鶴2， 王 磊1， 李 海3

（1.上海體育學院運動科學學院，上海200438；2.阿迪達斯體育（中國）有限公司，北京100022；3.四川內江師范學院體育學院，四川內江641000）

目的：觀察大鼠在過度訓練狀態(tài)下骨骼肌糖代謝的變化，探討過度訓練對糖代謝的影響。方法：將SD大鼠隨機分為對照組（7只，Con）、運動組（8只，Mtr）和過度訓練組（9只，Otr），進行9周跑臺訓練，其中Otr組后3周為力竭性運動。運動后分別測定骨骼肌糖原含量，LDH、PK、SDH、SOD酶的活性及MDA濃度，電鏡觀察肌組織的變化。結果：Otr組肌糖原含量較Mtr組降低，各種酶活性受到不同程度的抑制，MDA濃度升高，線粒體水腫，呈空泡狀。結論：大鼠連續(xù)力竭性運動所致過度訓練存在骨骼肌糖代謝功能紊亂，其可能與力竭性運動引起的自由基損害有關。

大鼠；過度訓練；肌糖原；自由基；線粒體

Author’s address1.School of Kinesiology，Shanghai University of Sport，Shanghai 200438，China；2.Adidas Sports（China）Co.，Ltd.Beijing 100022，China；3.School of Physical Education，Neijiang Normal University，Neijiang 641000，Sichuan Province，China

隨著運動員訓練水平的提高，競技水平表現(xiàn)出極值化，運動員之間的競爭變得更為激烈，導致訓練強度更大，訓練時間更長，技術難度更高，運動員更容易出現(xiàn)過度訓練；因此，預防過度訓練成為運動醫(yī)學工作者的重要任務。

過度訓練產生的機制較為復雜，到目前為止學界尚無統(tǒng)一的認識。在多種假說中，肌糖原耗損學說［1］是其中之一，C.M.McGowan等［2］也認為，過度訓練時機能下降與代謝紊亂無關，國內學者也嘗試通過補糖預防過度訓練的發(fā)生［3］；但也有資料顯示過度訓練的發(fā)生有肌糖原以外的因素參與［1］。為進一步了解糖代謝在過度訓練產生機制中的作用，我們通過觀察大鼠在過度訓練狀態(tài)下骨骼肌糖代謝的變化，探討過度訓練對糖代謝的影響。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象及分組 3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠24只，由第二軍醫(yī)大學提供，體重為（373.9± 29.91）g，隨機分為3組：安靜對照組（Con組）7只、中等強度訓練組（Mtr組）8只、過度訓練組（Otr組）9只。以國家標準嚙齒類動物飼料（由上海海軍醫(yī)學研究所動物中心提供）飼養(yǎng)，自由進食、飲水，室溫為20～25℃，相對濕度為45%～55%，每天光照12 h，一周適應性訓練。為避免組間和組內大鼠因活動而造成的差異，大鼠均飼養(yǎng)于標準飼養(yǎng)籠（長×寬 ×高為40 cm×27 cm×22 cm）內，每4～5只一籠分籠飼養(yǎng)。

1.2 訓練方案

1.2.1 大鼠訓練方案 本實驗參照T.G.Bedford等［4］的大鼠訓練運動負荷標準，采用BCPF-98型生物醫(yī)學動物跑臺（由杭州立泰科技有限公司提供）進行訓練，跑臺坡度為5%，訓練時間為8周，每周訓練6 d，休息1 d，每周稱體重一次。具體訓練方案見表1。

表1 大鼠訓練方案Table 1 Training Protocol for Rats

1.2.2 過度訓練模型建立的依據(jù) 在實驗過程中當實驗大鼠出現(xiàn)下列2項時，定為過度訓練狀態(tài)［5-6］。

一是體重下降幅度大于一般訓練時體重的1/30。神態(tài)倦怠，眼神變得暗淡無光，毛發(fā)脫落成稀疏狀，進食量明顯減少。

二是運動能力明顯下降，跑速及時間減為原最大值的1/3～1/6。

1.3 取材 在大鼠8周訓練結束后36 h，3組大鼠被腹腔麻醉后處死并迅速取出比目魚肌、跖肌和腓腸肌紅肌部分進行預處理，其中一部分標本置于固定液中用于石蠟切片制作，一部分標本入液氮速凍后移入-80℃冰箱，用于生化分析。另取部分腓腸肌紅肌置于4℃的戊二醛專用電鏡固定液中用于電子顯微鏡觀察。

1.4 測試指標及方法 肌糖原、SOD酶活性、MDA、丙酮酸激酶（PK）活性、琥珀酸脫氫酶（SDH）活性、乳酸脫氫酶（LDH）活性、ATP酶（ATPase）活性均使用南京建成生物研究所的商用試劑盒測定。

糖原染色：采用高碘酸—希夫染色。配制高碘酸氧化劑和Schiff試劑4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

染色步驟：1）切片脫蠟至水；2）0.5%高碘酸氧化5～8 m in；3）流水沖洗2min，再用蒸餾水洗；4）入無色品紅液，于暗處加蓋作用10～20 min；5）0.5%偏重亞硫酸鈉液滴洗2次，每次約1 m in；6）流水沖洗5 m in；7）亮綠水溶液復染數(shù)秒；8）稍水洗后常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封固。

電鏡：取經戊二醛固定的標本，用0.1 mol/L PBS緩沖液洗滌2次，1%鋨酸后固定30～60 min，常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋、超薄切片、鈾鉛染色。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件處理所有數(shù)據(jù)，均用平均數(shù)±標準差表示。組間比較分別采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有高度顯著性。

2 實驗結果

2.1 大鼠一般情況 安靜組大鼠和中等強度訓練組大鼠均活潑好動，皮毛緊密光滑，干凈潤澤，目光有神，體重穩(wěn)步增長。過度訓練組大鼠目光倦怠無光，皮毛枯槁，體型瘦弱，體重嚴重下降，第7周開始多數(shù)大鼠不能完成規(guī)定訓練量，驚懼，反應遲鈍。宰殺時發(fā)現(xiàn)腸道發(fā)黃，脹氣嚴重，皮下脂肪稀薄。過度訓練組與安靜對照組和中等強度訓練組的大鼠每周體重增長具有顯著性差異（P＜0.05）。過度訓練組大鼠體重從第3周開始明顯下降，而中等強度訓練組大鼠體重相對于安靜組無顯著性變化。

表2 實驗前后各組大鼠體重變化 gTable 2 Changes in Rats Body Weight during Breeding in Various Groups

表2表明，實驗前過度訓練組與安靜對照組和中等強度訓練組的大鼠體重無顯著性差異（P＞0.05）。實驗后過度訓練組大鼠體重相對于安靜對照組和中等強度訓練組大鼠，體重顯著性下降（P＜0.05）。

2.2 大鼠肌糖原含量

2.2.1 運動對大鼠肌糖原含量的影響 表3顯示，Mtr組比目魚肌肌糖原含量高于Con組，且差異具有顯著性（P＜0.01），Otr組比目魚肌肌糖原含量相比于Con組則稍有增高趨勢，但差異不具有顯著性（P＞0.05），但與Mtr組比較顯著降低（P＜0.01）。

表3 大鼠肌糖原含量 mg/gTable 3 The Muscle Glycogen Content of Rats

Mtr組跖肌肌糖原含量相比于Con組有增高趨勢，但差異不具有顯著性（P＞0.05）；Otr組跖肌肌糖原含量相比于Con組則有下降趨勢，但差異同樣不具有顯著性（P＞0.05），而較Mtr組顯著降低（P＜0.05）。

2.2.2 肌糖原染色 對3組大鼠跖肌和比目魚肌進行糖原染色顯示，糖原在肌纖維的一側著色較深，3組間的著色程度在鏡下不易區(qū)分（圖1）。

圖1 大鼠肌糖原染色注：上圖為跖肌，下圖為比目魚肌，40×10。Figure 1. Muscle Glycogen Dyeing of Rats

2.3 骨骼肌代謝酶活性的變化

2.3.1 運動對大鼠骨骼肌中LDH活性的影響 表4顯示，跖肌中Mtr組LDH活性稍低于Con組，且差異不具有顯著性（P＞0.05）；Otr組LDH活性明顯低于Con組和Mtr組，差異均具有顯著性（P＜0.01）。比目魚肌中Mtr組LDH活性稍高于Con組，且差異不具有顯著性（P＞0.05），而Otr組LDH活性明顯低于Con組，差異具有顯著性（P＜0.01），但與Mtr組之間無明顯差異（P＞0.05）。

表4 大鼠骨骼肌代謝酶活性測定結果 U/mgprotTable 4 Determination of Skeletal Muscle Metabolic Enzymes Activity of Rats

2.3.2 運動對大鼠骨骼肌中PK活性的影響 表4顯示，跖肌中Mtr組PK活性稍低于Con組，且差異不具有顯著性（P＞0.05），而Otr組PK活性明顯低于Con組和Mtr組，差異均具有顯著性（P＜0.01）。比目魚肌中Mtr組PK活性稍低于Con組，且差異不具有顯著性（P＞0.05），而Otr組PK活性明顯低于Con組和Mtr組，差異分別為非常顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）。2.3.3 運動對大鼠骨骼肌中SDH活性的影響 表4顯示，跖肌中Mtr組SDH活性明顯高于Con組，且差異具有顯著性（P＜0.01）；Otr組SDH活性明顯低于Con組和Mtr組，差異為非常顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）。比目魚肌中Mtr組SDH活性明顯高于Con組，且差異具有顯著性（P＜0.01）；Otr組SDH活性顯著高于Con組（P＜0.01），但顯著低于Mtr組（P＜0.01）。

2.3.4 運動對大鼠骨骼肌中ATPase活性的影響 表4顯示，腓腸肌中Mtr組ATPase活性與Con組比較無顯著性差異（P＞0.05）；Otr組ATPase活性顯著低于Con組和Mtr組，差異為非常顯著（P＜0.01）。

2.4 腓腸肌線粒體變化 圖2顯示：Con組線粒體外膜完整，肌原纖維排列整齊、肌絲完整（×7 000）；Mtr組線粒體結構完整，肌原纖維排列整齊、數(shù)量增加，有生理性補償行為（×7 000）；Otr組線粒體腫脹，水性變及空泡化，內膜、嵴破壞溶解改變（×7 000）。

圖2 大鼠腓腸肌電子顯微鏡觀察結果Figure 2. Gastrocnemius of Rats under Electron Microscopy

2.5 腓腸肌MDA濃度及SOD活性變化 表5顯示：腓腸肌中Mtr組MDA濃度較Con組顯著降低（P＜0.05）；Otr組MDA顯著高于Mtr組（P＜0.05），較Con組有升高趨勢，但未達到統(tǒng)計意義（P＞0.05）。

腓腸肌中Mtr組SOD活性與Con組比較顯著增加（P＜0.05）；Otr組SOD活性顯著低于Mtr組（P＜0.05），較Con組有升高趨勢，但未達到統(tǒng)計意義（P＞0.05）。

表5 大鼠腓腸肌MDA濃度及酶活性測定結果Table 5 Determination of Gastrocnemius MDAContent and Enzymes Activity of Rats

3 討論

6周遞增負荷訓練加3周力竭性運動，引起實驗大鼠體重下降，神態(tài)倦怠，毛發(fā)脫落成稀疏狀，運動能力明顯下降，顯示過度訓練動物模型成功建立［5-6］。

在耐力訓練中，運動前服糖被認為可提高運動耐力，運動后服糖被認為有利于超量恢復，兩者均與肌糖原含量有關；因此，肌糖原含量與機體的運動能力有著密切的關聯(lián)。運動中肌糖原大量消耗被認為是引起運動性疲勞的因素之一，也有學者認為連續(xù)大強度運動可致肌糖原持續(xù)下降，是引起過度訓練的可能因素之一［7］。在實驗中發(fā)現(xiàn)，6周漸進性訓練后連續(xù)3周大強度的力竭性訓練所致的過度訓練大鼠，肌糖原水平與正常訓練大鼠比較明顯降低；但與正常對照組比較并無顯著性差異，顯示持續(xù)力竭性運動引起的過度訓練與肌糖原含量的聯(lián)系可能并不密切。文獻［8］也顯示在肌糖原含量正常的情況下也可能發(fā)生過度訓練，因此，過度訓練產生的機制應有更深層次的原因。我們在前期的研究［9］中，提出運動中骨骼肌細胞內能量利用障礙在過度訓練的產生機制中起著重要的作用。為此，我們觀察了參與細胞糖代謝的部分酶的活性，以便了解過度訓練狀態(tài)下對糖代謝的影響。

正常的運動訓練可使骨骼肌中代謝的酶活性提高［10］，在過度訓練狀態(tài)下，相關的代謝酶活性可能受到抑制。在糖代謝中，LDH是在無氧條件下催化丙酮酸轉變?yōu)槿樗岬拿?，我們觀察到在過度訓練的大鼠骨骼肌中該酶活性受到抑制，這可能與過度訓練條件下最大乳酸能力下降有關［11-12］，這一變化也可能降低了機體無氧運動的能力。PK位于胞漿中，為糖的無氧酵解和有氧氧化共同代謝途徑中的激酶，SDH位于線粒體內，是糖氧化過程中最活躍的酶［10］，兩者在過度訓練時均受到抑制，提示在過度訓練條件下，骨骼肌糖的有氧代謝途徑也受到阻礙。ATPase是線粒體在參與能量代謝中的最終調節(jié)環(huán)節(jié)，催化ATP的合成，實驗顯示該酶活性降低，表明過度訓練時骨骼肌的能量代謝在不同環(huán)節(jié)上均受到抑制。我們認為，在過度訓練狀態(tài)下，骨骼肌存在代謝障礙的問題，至少在糖代謝方面如此。E.de Graaf-Roelfsema等［13］對賽馬的實驗觀察中發(fā)現(xiàn)，過度訓練時葡萄糖代謝率和葡萄糖代謝率與血漿胰島素濃度的比值明顯降低，也從另一個側面支持過度訓練狀態(tài)下存在糖代謝障礙的問題。

自20世紀80年代初發(fā)現(xiàn)運動可引起自由基對組織的損害作用［14］，隨后大量的研究發(fā)現(xiàn)自由基的產生與劇烈運動即刻或運動后的許多細胞、組織、器官水平代謝的紊亂有直接關系［15-16］。在過度訓練中，引起機體運動源性自由基的生成增加，它們不僅損傷生物膜的功能，也可對細胞內的信號轉導通路產生影響，由此影響組織能量代謝［17］。在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)，過度訓練大鼠骨骼肌中MDA含量顯著升高，而SOD活性受到抑制，這可能是引起過度訓練時糖代謝受阻的直接原因。自由基主要由線粒體產生，除了攻擊細胞膜外，本身可對線粒體造成損傷。在對過度訓練大鼠的腓腸肌進行電鏡觀察時我們發(fā)現(xiàn)，線粒體明顯腫脹，有水性變及空泡化，內膜、嵴破壞溶解改變。在這種情況下，如果繼續(xù)發(fā)展，肌肉將發(fā)生自溶和萎縮性改變，同時肌肉對刺激的反應下降，極易疲勞。這種病理性變化勢必影響能量的產生，引起代謝紊亂，因此，自由基在過度訓練時細胞的功能下降發(fā)揮著重要的作用。

4 結論

大鼠連續(xù)力竭性運動所致過度訓練存在骨骼肌糖代謝功能紊亂，可能與連續(xù)力竭性運動引起的自由基損害有關。

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Effects of Overtraining on Glucose Metabolism in Rat Skeletal Muscle

∥LIU Wuyi1，QIAN He2，WANG Lei1，LI Hai3

Objectives：It is to observe the changes in glucose metabolism of skeletal muscle in rat after overtraining and explore the effects of overtraining on glucose metabolism.Methods：SD rats were randomly divided into group Con（7，sedentary control），group Mtr（8，moderate intensity training）and group Otr（9，over training）.Both training groups were doing 9-week treadmill training.Skeletal muscle glycogen levels，LDH，PK，SHD，SOD activity and MDA concentrations were determined and morphological changes of muscular tissue were observed by electron microscopy after the 9-week training.Results：Muscle glycogen levels in group Otr were lower compared with that in group Mtr.A variety of enzymatic activity was subjected to varying degrees of inhibition.MDA concentrations increased，and morphology of mitochondria was swelling to be vacuoles. Conclusions：The dysfunction of glucose metabolism in rat skeletal muscle after overtraining is probably owing to the free radical impairment from the exhaustive exercise.

rat；overtraining；glycogen；free radical；mitochondria

G804

A

1000 -5498（2013）03 -0060 -04

2012 -12 -17；

2013 -02 -12

上海市人類運動能力開發(fā)與保障重點實驗室（上海體育學院）資助項目（11DZ2261100）

劉無逸（1955 -），男，浙江寧波人，上海體育學院副教授，博士；Tel：（021）51253248，E- mail：lwy3248 @yahoo.com.cn