宮頸細胞DNA定量分析、HPV-DNA檢測與液基細胞學檢查在宮頸癌篩查中的應用價值

趙春蘭 張會辰 王建 李利

宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤的第二位。全世界每年約20萬女性死于宮頸癌，而新發(fā)宮頸癌病例更高達 45.9 ～50 萬人［1，2］，其中我國每年新發(fā)病例 13.15 萬，占世界新發(fā)病例的28.7%［3］，約95%的宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染有關(guān)［4，5］。近些年，液基細胞學(TCT)檢查逐步替代了傳統(tǒng)的宮頸涂片，TBS診斷法使細胞學與組織學的診斷術(shù)語得到了較好的統(tǒng)一，但細胞病理學診斷方法作為一種篩查手段，對宮頸癌前病變的發(fā)展趨勢無法進行預測評估。有學者建議把HPV-DNA檢測及宮頸細胞DNA定量分析等手段應用于宮頸病變的早期診斷［5］。本研究通過比較分析TCT、HPV-DNA和ICM-DNA定量分析3種篩查方法在宮頸癌及癌前病變篩查中的應用價值，旨在為宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及合理治療提供一些理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年9月至2009年12月于保定市婦幼保健院行宮頸脫落細胞學檢查的患者3000 例，年齡17～65歲;孕次0～7次，平均2次;產(chǎn)次為0～4次，平均為1次。

1.2 試劑 液基薄層細胞保存液為湖北德立森科技有限公司產(chǎn)品，人乳頭狀瘤病毒(HPV)核酸擴增分型檢測試劑盒及HPV-DNA分型檢測儀購自凱普生物儀器有限公司，全自動細胞DNA定量分析儀產(chǎn)自武漢蘭丁醫(yī)學高科技公司。

1.3 方法

1.3.1 TCT

1.3.1.1 標本采集與制備:臨床醫(yī)師用宮頸刷在3000 例受檢者宮頸鱗柱狀上皮交界處單向旋轉(zhuǎn)6圈以上收集脫落細胞，將收集的宮頸細胞連采樣刷頭一并置入盛有保存液的標本瓶中，送檢至我院病理科，由專門技術(shù)人員用液基薄層細胞制片儀將標本制成直徑為2cm的薄層液基細胞涂片，95%乙醇固定15～30 min，行巴氏染色，標本瓶常規(guī)保存1年。

1.3.1.2 判定細胞學診斷結(jié)果陽性的標準為［6－8］:①LSIL 及以上需要進行病理活檢的病例視為細胞學檢查陽性結(jié)果;②鱗狀上皮細胞癌和腺癌統(tǒng)稱為癌(carcinoma)。

1.3.2 HPV-DNA 檢測

1.3.2.1 標本采集與保存:對細胞學檢查篩查出的ASC-US及以上病變患者行HPV-DNA檢測。用雜交捕獲二代檢測系統(tǒng)專用配套采樣器采集宮頸細胞標本，將標本連同采樣刷頭一并置入保存液。標本置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)上機檢測。

1.3.2.2 用雜交捕獲二代系統(tǒng)檢測高危型HPV病毒:通過雜交捕獲二代檢測系統(tǒng)對所取標本行 HPV16、18、31、33、35、39、45等13種常見的HPV高危型檢測。并設(shè)置陽性對照和陰性對照。

1.3.3 ICM-DNA 定量分析

1.3.3.1 標本采集與制備:將TCT篩查出的ASC-US及以上病變患者的剩余保存液再次制片，95%酒精固定后，經(jīng)Feulgon染色行DNA定量分析。

1.3.3.2 DNA倍體檢測:制備好的玻片行全自動細胞圖像分析儀掃描:玻片置于顯微鏡載物臺，以同一玻片上淋巴細胞核DNA含量作為正常2倍體參照細胞，保證參照細胞與分析細胞同時固定、染色，并在相同光照系統(tǒng)下進行測量。

1.3.4 病理組織學檢查:對TCT篩查出的陽性病例同時行HPV-DNA檢測和組織病理學檢查。根據(jù)2004年世界衛(wèi)生組織腫瘤分類及診斷標準叢書“乳腺及女性生殖器官腫瘤病理學和遺傳學”分冊，關(guān)于宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌的診斷標準及相關(guān)文獻［9，10］，將病理組織學檢查 CINⅡ級及以上病變定為陽性。

1.4 3種檢測方法的評價 采用靈敏性、特異性及準確率指標將三種檢測方法與病理組織學進行比較。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，進行多配對樣本的非參數(shù)檢驗(Pearson 2檢驗)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TCT與病理組織學驗證結(jié)果 TCT結(jié)果:ASC-US及以上病變377例，其中陰性(ASC-US)275例，陽性102例(包括LSIL 62例、HSIL 40例、SCC 0例)。病理組織學檢查結(jié)果:TCT陰性275例，其中組織學陰性(CINⅠ級及BCC病例)255例，組織學陽性(CINⅡ級及以上)20例;TCT陽性102例，其中組織學陰性52例，組織學陽性50例。TCT的敏感性為71.43%，特異性為 83.06%，準確率為 80.90%。見表 1、4。

表1 TCT與病理組織學驗證 例

2.2 HPV-DNA檢測與病理組織學驗證結(jié)果 HPV-DNA檢測陰性185例，陽性192例。病理組織學檢查結(jié)果:HPV-DNA陰性185例中，組織學陰性(CINⅠ級及BCC病例)182例，陽性(CINⅡ級及以上)3例;HPV-DNA陽性192例，其中組織學陰性125例，陽性67例。HPV-DNA檢測的敏感性為95.71%，特異性為59.28%，準確率為66.05%。見表2、4。

表2 HPV-DNA檢測與病理組織學驗證 例

2.3 CM-DNA檢測與病理組織學驗證結(jié)果 ICM-DNA檢測陰性287例，陽性90例。病理組織學檢查結(jié)果:ICM-DNA檢測陰性組287例，其中組織學陰性270例，陽性17例;ICM-DNA檢測陽性組90例，其中組織學陰性37例，陽性53例。ICM-DNA檢測的敏感性為 75.71%，特異性為 87.95%，準確率為85.68%。見表 3、4。

表3 ICM-DNA檢測結(jié)果與病理組織學驗證 例

2.4 3種檢測方法相比較 HPV-DNA檢測的敏感性高于TCT和ICM-DNA檢測，而TCT特異性高于其他兩項檢查(P＜0.05)，在3種檢測方法中ICM-DNA檢測的準確率最高(P＜0.05)。見表4。

表4 TCT、HPV-DNA檢測、ICM-DNA檢測的比較 %

3 討論

宮頸癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，嚴重危害廣大女性的生命健康，篩查宮頸癌成為目前研究的熱點［11］。

細胞學檢查是1928年由Papanicolaou提出，運用宮頸脫落細胞刮片以篩查宮頸癌的方法［12，13］。宮頸癌的病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，目前可以分離鑒定出的HPV有100多種，其中與宮頸病變有關(guān)的有30余種，根據(jù)其致病性分為高危型、中危險型和低危型三種，高危型HPV是宮頸癌及癌前病變的主要原因，低危型主要引起生殖道的良行病變，中危型多導致CIN。而生殖道HPV感染在有性生活的人群中普遍存在，在每個女性一生中都有感染的可能性，但60% ～70%的人僅僅是HPV陽性而沒有宮頸病變，宮頸癌變的發(fā)生還與其他因素有關(guān)，如感染持續(xù)的時間、身體狀況等。由于HPV感染早于形態(tài)學改變，檢測HPV具有早期預警和跟蹤檢測意義。

宮頸癌的發(fā)生是一個多因素、多途徑、多步驟的過程，涉及到癌基因的激活與抑癌基因的失活，染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導致非整倍體的產(chǎn)生，而非整倍體又是宮頸病變進展中的一個顯著性標志［14］。因此，可以通過檢測細胞內(nèi)DNA含量的變化進行腫瘤細胞及非腫瘤細胞的鑒別診斷。

3.1 液基細胞學對宮頸癌及癌前病變篩查的價值 TCT通過液基薄層細胞學技術(shù)，去除了玻片上的粘液、血液和大量的炎細胞，可以更清晰的觀察細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，且避免了刮板上大量細胞的丟失［15］，與巴氏刮片相比細胞學篩查的準確度和敏感度有了較大的提高。錢德英［16］認為TCT雖然是宮頸癌前病變篩查的一大革命，但是判讀涂片過程中易受到人為因素的影響，陰性率較高，易漏檢宮頸癌及癌前病變。在本實驗中TCT的敏感性和準確率均較其他兩者低，特異性高于HPVDNA檢測但是低于ICM-DNA檢測。TCT操作簡單，是一種經(jīng)濟便捷的宮頸癌及癌前病變的篩查方法，且液基細胞學制片方法是進行ICM-DNA檢測的基本步驟，便于進行圖像的掃描。此外，液基細胞學與檢測高危型HPV聯(lián)合應用除可提高篩查的敏感性［17］。

3.2 HPV-DNA檢測對宮頸癌及癌前病變篩查的價值

3.2.1 HPV-DNA檢測的常用方法:HPV感染與宮頸癌的關(guān)系是目前研究的熱點，其檢測主要依賴于核酸探針雜交技術(shù)。目前用于檢測HPV-DNA主要有3種核酸雜交方法，即直接核酸探針法、雜交信號放大法和靶 DNA擴增法［18，19］。

3.2.2 HPV-DNA檢測對宮頸癌及癌前病變篩查的價值:常規(guī)細胞學診斷HPV感染依賴于鏡下細胞的形態(tài)學改變，即出現(xiàn)特征性的挖空細胞為診斷依據(jù)，易出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果［20］。雜交捕獲法(HC2)是當前較為先進的檢測方法。在本研究中，HPV-DNA檢測的敏感性高但特異性低，準確率高于液基細胞學檢查而低于ICM-DNA檢測。國內(nèi)有研究認為，HPVDNA檢測在對宮頸病變篩查中的敏感性為60% ～70%，特異性為80% ～90%［21］，本實驗結(jié)果與其存在一定的差異，考慮有以下幾種原因:①高危型HPV的檢出說明患者感染了HPV，但是有高危型HPV感染不一定引起細胞形態(tài)的異常改變，是否發(fā)展為宮頸癌及癌前病變與感染持續(xù)的時間、患者免疫狀態(tài)等因素有關(guān)，因此患者病理組織學檢查可能未檢出陽性病變。②本實驗中，考慮到CINⅠ級患者的臨床處理與CINⅡ、CINⅢ患者不同，甚至可以不做臨床處理，將CINⅠ級病例定為陰性結(jié)果，造成實驗中假陰性比例減少，敏感性增高。若按CINⅠ級為陽性結(jié)果則敏感性為73.16%，則與上述研究結(jié)果相近。

本研究顯示，HPV陽性病例192例，病理組織學結(jié)果只有70例在CINⅡ以上病變，其余125例中53例為BCC，72例為CINⅠ級，除了與感染持續(xù)的時間、患者免疫狀態(tài)等因素有關(guān)以外，還應考慮到宮頸活檢取材是否準確及醫(yī)生診斷的主觀性等人為因素。對于假陰性病例，不排除有其他原因?qū)е聦m頸癌前病變及宮頸癌的因素，有報導約5%的宮頸癌及癌前病變?yōu)榉歉呶Ｐ虷PV引起。

HPV檢測具有早期預警和跟蹤檢測意義，尤其當宮頸細胞學檢查(TCT)提示非典型細胞(ASCUS)時，不能確定是炎癥還是有癌前病變的情況存在，就要依據(jù)HPV檢測結(jié)果來決定行陰道鏡檢查或隨診觀察。

3.3 ICM-DNA檢測對宮頸癌及癌前病變篩查的價值

3.3.1 ICM-DNA檢測的原理及優(yōu)點:ICM是以Lamber-Beer定律為基礎(chǔ)，結(jié)合細胞、組織和顯微成像儀器的特點，測定細胞學、組織學樣品的成像細胞圖像的光度，以評估其化學成分的含量［22］。ICM-DNA檢測能夠客觀、精確的測定細胞核的DNA倍體值，獲得了腫瘤生物學特征信息［23，24］，為細胞形態(tài)學檢查提供了有價值的補充，自動化的分析過程也很大程度上減少了閱片者主觀因素的影響。

3.3.2 ICM-DNA檢測對宮頸癌及癌前病變篩查的價值:染色體重組、片段的丟失或增多及染色體數(shù)目的改變，可引起基因的非整倍體擴增，導致腫瘤的發(fā)生。DNA非整倍體的出現(xiàn)是染色體異常的標志。本研究采用全自動細胞圖像分析儀對液基細胞學檢查篩查出的ASCUS及以上的病變共計377例患者行宮頸細胞DNA倍體測定，檢測出大于5c細胞標本90例，其特異性為87.95%，準確率為85.68%，高于液基細胞學和HPVDNA檢測，敏感性卻低于HPV檢測。ICM-DNA檢測假陰性病例和假陽性病例分別為17例和37例，分析有以下因素造成:①良性非整倍體細胞:研究發(fā)現(xiàn)HPV病毒、HIV病毒感染可引起＞5c的非整倍體細胞。另外，放射治療、激素治療和維生素B12缺乏及激素水平紊亂均可導致細胞非整倍體擴增，但與腫瘤性非整倍體細胞不同的是當這些影響因素去除后，細胞可恢復正常整倍體。這些因素往往只引起散在的＞5c細胞，而不會形成非整倍體細胞峰。因此，當發(fā)現(xiàn)有非整倍體細胞，排除這些因素后，就能做出正確的診斷。②DNA-ICM硬件和軟件系統(tǒng)問題:細胞圖像分析DNA倍體測定是一種較新的DNA定量細胞研究，重疊細胞或成團細胞的分割在該系統(tǒng)中尚存在缺陷，儀器往往將這類細胞歸為垃圾而不予掃描，從而引起誤診。不過宮頸鱗狀細胞成團的機會少，液基薄層制片中細胞分布均勻而分散，此情況較少見。③檢測人員水平:檢測出有DNA倍體＞5c及以上倍體值細胞的玻片均要求專門細胞技術(shù)人員在顯微鏡下對這些細胞進行核實，以排除系統(tǒng)問題導致假陰性和假陽性情況。染色過程中操作不當，細胞退變嚴重，DNA分子結(jié)合了較多染色劑，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。酸化不全，化學鍵沒有全部打開，DNA分子染色差，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

3.4 三種篩查方法的評價 有效的篩查手段可以降低宮頸癌的發(fā)病率，研究表明，每年或每兩年1次宮頸癌篩查可以使宮頸癌的發(fā)病率和病死率明顯下降［25－27］。在本實驗中三種方法相比，宮頸液基細胞學檢查簡單易行，無創(chuàng)傷且價格較低，易于被患者接受，但敏感性和準確率均較低，受閱片者主觀影響大;宮頸細胞DNA定量分析能提供形態(tài)學之外的腫瘤生物學信息，特異性和準確率均高于其他兩項檢測，并且全自動圖像分析系統(tǒng)分析過程有效降低了人為因素的影響，其結(jié)果客觀準確，彌補了細胞病理學診斷的不足，適用于大規(guī)模的宮頸癌及癌前病變篩查工作。HPV-DNA檢測是直接針對病因的檢測，敏感性高，能夠?qū)⒋嬖跐撛诎l(fā)病風險的婦女篩選出來，進行針對性的治療

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