地佐辛在雌激素干擾下對(duì)切口痛大鼠痛行為學(xué)及脊髓c-fos蛋白表達(dá)的影響

陳江 程橋

隨著人們對(duì)疼痛研究的不斷深入，阿片類藥物也愈加受到關(guān)注，在對(duì)阿片類藥物鎮(zhèn)痛效果的大量研究中發(fā)現(xiàn)疼痛存在顯著性別差異，即女性的痛閾和對(duì)疼痛的耐受性明顯高于男性［1］。其中嗎啡類止痛劑以及納布啡、噴他佐辛等阿片物質(zhì)的激動(dòng)劑/拮抗劑的鎮(zhèn)痛效果存在兩性差異［2］。地佐辛是一種新型的阿片類藥物，其鎮(zhèn)痛效果是否存在性別差異目前備受爭議。Fos蛋白作為一種疼痛在分子水平的標(biāo)志，可作為神經(jīng)元興奮的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)通過注射外源性雌激素，觀察地佐辛在雌激素干擾下對(duì)切口痛大鼠行為及脊髓c-fos蛋白表達(dá)的影響，探討雌激素對(duì)地佐辛鎮(zhèn)痛效果的影響。

1 資料與方法

1.1 主要藥物和試劑 17-β雌二醇購自上海博蘊(yùn)生物公司，地佐辛購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司。大鼠C-fos ELISA試劑盒購于上海西塘生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 健康成年雌性SD大鼠32只，重量250～280 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將32只大鼠分為去卵巢手術(shù)組（OVX+V）、雌激素組（OVX+E）、地佐辛組（OVX+D）和雌激素+地佐辛組（OVX+E+D），各8只。雌激素組于造模前3 h皮下注射17 β-雌二醇（0.2 mg/100 g），地佐辛組于造模后尾靜脈注射地佐辛（0.1 mg/100 g）；雌激素+地佐辛組按相應(yīng)的劑量以及時(shí)間點(diǎn)分別給予雌激素和地佐辛。

1.3 卵巢切除術(shù) 0.3%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠，腹正中切口(1～1.5 cm)，沿子宮找到雙側(cè)卵巢并結(jié)扎摘除止血，術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射抗生素。在安靜、溫暖和避強(qiáng)光的環(huán)境中飼養(yǎng)4周。

1.4 切口痛模型的制備 大鼠于實(shí)驗(yàn)前放置在安靜、溫暖和避強(qiáng)光的環(huán)境中飼養(yǎng)，將大鼠麻醉后，消毒大鼠的左側(cè)后爪，用Brennan等［3］法從足底近端0.5 cm處向趾部做1 cm長的條狀切口，切開皮膚后，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割，保持其起止附著點(diǎn)的完整，紗布按壓止血后，用細(xì)線縫合皮膚。手術(shù)過程持續(xù)約5 min。

1.5 行為學(xué)觀察及評(píng)分 行為學(xué)改變主要發(fā)生在傷害性刺激后1 h，術(shù)后1 h觀察大鼠行為學(xué)改變，觀察其左側(cè)后爪及其負(fù)重情況。后爪著地且能夠負(fù)重計(jì)0分，后爪著地不負(fù)重計(jì)1分，后爪翹起不著地計(jì)2分。5 min觀察1次，每次1 min，以1 min內(nèi)最常采用的姿勢(shì)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，共觀察1 h(0～24分)。以術(shù)側(cè)足評(píng)分減去對(duì)側(cè)足評(píng)分即為所得累積疼痛評(píng)分。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)脊髓fos蛋白表達(dá)情況 手術(shù)刺激后2 h，取每只大鼠腰段脊髓，大鼠的下肢神經(jīng)相對(duì)應(yīng)的脊髓節(jié)段為腰膨大，大致包括腰髓的4～6節(jié)段，相應(yīng)的位置為平胸13肋向下1 cm的范圍，即按此范圍取材，具體方法如下：（1）腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，大鼠取俯臥位固定；（2）背部正中切口剪開大鼠皮膚，分開筋膜和肌肉，暴露胸椎和腰椎；（3）于13浮肋水平向下1.5 cm咬開相應(yīng)部位的棘突和椎板，充分暴露脊髓；（4）平13肋向下剪取長度約1 cm的脊髓組織；（5）將所取得脊髓組織稱重后置于勻漿緩沖液中勻漿，20000 r/min，離心30 min，取上清液待用，樣本在-70℃保存。按照試劑盒說明進(jìn)行ELISA法檢測(cè)fos蛋白含量，計(jì)算脊髓組織中fos蛋白的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所得數(shù)據(jù)均以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 累計(jì)疼痛評(píng)分 手術(shù)組大鼠均表現(xiàn)術(shù)側(cè)后爪翹起，偶爾著地但不負(fù)重等疼痛行為。與手術(shù)組比較，雌激素組、地佐辛組、地佐辛+雌激素組疼痛均明顯減輕（P＜0.05）；與雌激素組比較，雌激素+地佐辛組疼痛也明顯緩解（P＜0.05）；與地佐辛組比較，雌激素+地佐辛累計(jì)疼痛評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四組大鼠疼痛累計(jì)評(píng)分的表達(dá)變化

2.2 脊髓c-fos蛋白表達(dá) 與手術(shù)組比較，地佐辛組，雌激素組，地佐辛+雌激素組c-fos表達(dá)量均明顯下降（P＜0.05）；與雌激素組比較，地佐辛+雌激素組c-fos表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與地佐辛組比較，地佐辛+雌激素組c-fos表達(dá)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 四組大鼠脊髓c-fos蛋白的表達(dá)變化（pg/mL）

3 討論

Fos蛋白是原癌基因c-fos的表達(dá)產(chǎn)物，c-fos基因是一種即刻早期基因，正常情況下，在細(xì)胞內(nèi)很少表達(dá)，當(dāng)機(jī)體受到傷害性刺激時(shí)后能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)不同部位表達(dá)，因此c-fos可作為神經(jīng)元興奮的標(biāo)志，是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)最具有代表性的即刻早期基因［4］。雌激素主要通過雌激素受體來發(fā)揮作用，雌激素受體(estrogen receptors，ERs)是甾體激素受體，其廣泛分布于生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)。目前神經(jīng)解剖學(xué)研究顯示，ERs廣泛分布于痛覺傳遞和調(diào)制通路中，如背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、臂旁核、脊核、下丘腦、大腦邊緣系和幾個(gè)皮質(zhì)區(qū)等區(qū)域，并通過激活不同部位的雌激素受體參與痛覺的廣泛調(diào)節(jié)［5］。本實(shí)驗(yàn)中我們采用Fos蛋白作為疼痛刺激的標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠給予外源性雌激素后，疼痛評(píng)分降低，c-fos表達(dá)明顯減少，再次證實(shí)雌激素可以降低或逆轉(zhuǎn)卵巢切除大鼠的增加的疼痛敏感性，起到抗疼痛過敏作用。

地佐辛是一種新型的阿片類藥物，為阿片受體混合激動(dòng)-拮抗劑，為κ受體激動(dòng)劑、 受體拮抗劑［6］，其安全性高，不良反應(yīng)少，鎮(zhèn)痛滿意率高于嗎啡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠和雌激素組大鼠在給予地佐辛后，疼痛評(píng)分和c-fos表達(dá)量均明顯下降，這和以前的研究結(jié)果一致，表明地佐辛確實(shí)可以發(fā)揮明顯的鎮(zhèn)痛作用，但是地佐辛聯(lián)合雌激素組和單用地佐辛組比較，疼痛評(píng)分和c-fos表達(dá)量變化均不明顯，其具體原因可能為：地佐辛為阿片受體混合激動(dòng)-拮抗劑，而雌激素也能夠雙向影響阿片系統(tǒng)，首先雌激素可以通過減少L-精氨酸/NO/cGMP通路來下調(diào)κ阿片受體數(shù)量或功能，從而減弱TMJκ調(diào)節(jié)的鎮(zhèn)痛。其可能通過降低κ阿片受體mRNA的合成或者增加這些纖維的κ阿片受體mRNA降解來下調(diào)功能性阿片受體的數(shù)量，也可能通過增加GRKs的mRNA的轉(zhuǎn)錄，激活GRK/抑制蛋白系統(tǒng)從而導(dǎo)致κ阿片受體脫敏，減弱阿片受體的功能［7］。其次，有研究顯示雌激素可增加疼痛誘導(dǎo)的μ阿片受體在大腦中的結(jié)合，增加μ阿片受體的有效性，這表明外源性雌激素可增強(qiáng)內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的功能。雌二醇治療可能增加大鼠海馬和丘腦μ結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目；同時(shí)雌激素還可導(dǎo)致中央視前區(qū)核和后背角中央杏仁核的μ阿片受體的內(nèi)化，這種內(nèi)化被認(rèn)為是突觸活性的標(biāo)志；并雌激素還可作用于阿片受體突觸前神經(jīng)元，從而增加內(nèi)源性阿片肽的釋放，從而降低大鼠疼痛敏感性。大量研究還表明，在外周初級(jí)傳入傷害性感受器上，μ阿片受體、κ阿片受體和GIRK通道是共表達(dá)的，雌激素可以通過調(diào)控GIRK 2參與對(duì)阿片鎮(zhèn)痛的調(diào)節(jié)，但其具體機(jī)制目前尚不清楚［8］。

綜上所述，雌激素對(duì)阿片受體存在雙向調(diào)節(jié)作用，不僅可以下調(diào)κ阿片受體數(shù)量或功能，還可以增加μ結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，而地佐辛為阿片受體混合激動(dòng)-拮抗劑，地佐辛與雌激素聯(lián)合用于去卵巢大鼠，兩者對(duì)阿片受體的這種作用可能會(huì)通過多種通路相互影響，部分抵消，相互中和，最終在我們的結(jié)果中看到地佐辛的鎮(zhèn)痛效果并沒有受到雌激素的太多干擾。但是具體機(jī)制可能受到多重因素的影響包括藥物本身的特殊性，如劑量、藥理作用、給藥途徑和給藥時(shí)間等，還有物種、基因型、年齡和性激素周期等。

我們的結(jié)果表明，基于本實(shí)驗(yàn)條件下，雌激素單獨(dú)應(yīng)用對(duì)c-fos表達(dá)有一定程度抑制作用，但雌激素對(duì)地佐辛的鎮(zhèn)痛效果沒有明顯的影響。

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