吉西他濱聯(lián)合培美曲塞不同序貫用藥時序?qū)UT-78細(xì)胞增殖及凋亡的影響

韓正祥 趙琳玉 杜秀平

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇 徐州 221002)

皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)屬于外周 T細(xì)胞淋巴瘤(PTCL)中的一種，其發(fā)病率低，但惡性程度高，可累及淋巴結(jié)和內(nèi)臟，預(yù)后較差。吉西他濱為核苷類藥物，雖然2011年的美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南確立了吉西他濱在淋巴瘤等腫瘤治療中的地位，但對提高PTCL的療效仍有限。一項研究顯示，吉西他濱治療進(jìn)展期CTCL患者，即使完全緩解率(CR)達(dá)到了22%，但中位緩解期只有10個月〔1〕。培美曲塞為多靶點葉酸拮抗劑，臨床研究顯示，培美曲塞對白血病細(xì)胞有細(xì)胞毒作用〔2〕，但對PTCL的研究較罕見。本研究旨在探討吉西他濱與培美曲塞單藥及不同聯(lián)合用藥時序方案對T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株HUT-78細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為擴(kuò)大CTCL臨床治療手段奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HUT-78，吉西他濱，培美曲塞，RPMI1640培養(yǎng)液，胎牛血清，膽囊收縮素八肽(CCK-8)試劑盒，膜聯(lián)蛋白V-綠色熒光蛋白(AnnexinV-FITC)凋亡試劑盒。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HUT-78常規(guī)培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 繪制生長曲線 連續(xù)7 d計數(shù)并繪制HUT-78細(xì)胞生長曲線。取對數(shù)生長期HUT-78細(xì)胞，離心，用完全培養(yǎng)基稀釋成2×105/ml的細(xì)胞懸液，按每孔1 ml接種于24孔板，分7組，每組3孔，1～7 d計數(shù)并繪制生長曲線。

1.4 分組 共分7組:單藥吉西他濱組(G組)、單藥培美曲塞組(P組)、吉西他濱、培美曲塞同時給藥組(G+P組)、先用吉西他濱24 h后用培美曲塞組(GP組)、先用培美曲塞24 h后用吉西他濱組(PG組)、陰性對照組(D組)及空白對照組。

1.5 CCK-8檢測增殖 取對數(shù)生長期的HUT-78細(xì)胞，離心，以RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1.6×105/ml，100μl/孔，接種于96孔板，每組6個平行復(fù)孔。按實驗設(shè)計進(jìn)行實驗，終止培養(yǎng)時，每孔加入10μl的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處每孔的光密度(OD)值。吉西他濱終濃度分別為:0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 μg/ml;培美曲塞終濃度 分 別 為:0.137、0.412、1.235、3.703、11.111、33.333、100 μg/ml，分別作用細(xì)胞24、48、72 h后測定其抑制率，根據(jù)濃度反應(yīng)曲線計算兩藥的IC50值。按照實驗分組，應(yīng)用兩藥的IC50濃度作用HUT-78細(xì)胞，作用72 h后測定其抑制率。

1.6 AnnexinV-FITC法檢測凋亡 每孔接種4.8×105個細(xì)胞，按照實驗分組，每組作用時間均為72 h，收集細(xì)胞，按照AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒說明書要求處理待測細(xì)胞，立即在流式細(xì)胞儀上檢測，實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗結(jié)果以表示，組間比較采用One-way ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUT-78細(xì)胞1～7 d的生長情況 于接種第2天進(jìn)入對數(shù)生長期，第6天進(jìn)入平臺期。見圖1。

2.2 吉西他濱單藥抑制HUT-78細(xì)胞增殖的結(jié)果 吉西他濱在終濃度為0.002 ～0.01 μg/ml范圍內(nèi)，作用細(xì)胞24、48、72 h，抑制率具有濃度依賴性及時間依賴性，即隨著藥物濃度的增加及藥物處理時間的延長，其抑制率逐漸增加。在24、48、72 h的時間點，其相鄰濃度的抑制率之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在不同的濃度下，其相鄰時間點的差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。48 h吉西他濱的IC50值為(7.50±0.71)×10－3μg/ml。見圖 2。

圖1 HUT 78細(xì)胞的生長曲線

圖2 吉西他濱對HUT 78細(xì)胞增殖的影響

2.3 培美曲塞單藥抑制HUT-78細(xì)胞增殖的結(jié)果 培美曲塞在終濃度為0.137～100 μg/ml范圍內(nèi)，作用細(xì)胞24、48、72 h，抑制率具有濃度依賴性及時間依賴性，隨著藥物濃度的增加及藥物處理時間的延長，其抑制率逐漸增加。在不同的時間點，100μg/ml及33.333μg/ml差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其余濃度組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在不同的濃度下，相鄰時間點的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。48 h培美曲塞的IC50值為(1.72±0.52)μg/ml。見圖3。

圖3 培美曲塞對HUT 78細(xì)胞增殖的影響

2.4 吉西他濱及培美曲塞不同處理組72 h對HUT-78細(xì)胞增殖的影響 以吉西他濱及培美曲塞IC50濃度作用于HUT-78細(xì)胞，單藥 G組抑制率為(55.85±2.72)%，P組為(76.37±2.83)%，聯(lián)合組中GHP組抑制率為(81.66±2.26)%，PG組為(86.53±2.43)%，均較單藥組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而PG組抑制率較G+P組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。GP組為(61.56±2.75)%，比單藥P組抑制率低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 AV-PI雙染法檢測吉西他濱及培美曲塞不同處理組于72 h對HUT-78細(xì)胞凋亡的影響 對于HUT-78細(xì)胞，對照組凋亡率為(6.66±0.60)%，與各藥物組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其中PG組凋亡率最高，為(31.69±1.16)%，其次為G+P組，凋亡率為(29.41±0.89)%，P組為(25.63±0.77)%，GP組為(13.90±0.49)%，G組為(12.02±0.91)%。各處理組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

CTCL是結(jié)外T細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一類亞型，占NHL的1% ～2%。因其具有明顯異質(zhì)性，標(biāo)準(zhǔn)化治療方案難以統(tǒng)一，早期以局部治療為主，進(jìn)展期則以全身治療為主或推薦進(jìn)行臨床試驗。早期患者的療效較好，但是進(jìn)展期患者療效差，特別是ⅡB期以上的Sézary綜合征(SS)和蕈樣霉菌病(MF)患者，中位生存時間僅1～4年〔3〕。在CTCL系統(tǒng)化療中，單藥氟達(dá)拉濱、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤及聯(lián)合用藥如:環(huán)磷酰胺+阿霉素+長春新堿+潑尼松(CHOP)、環(huán)磷酰胺+長春新堿+潑尼松(COP)、依托泊苷+潑尼松+長春新堿+環(huán)磷酰胺+多柔比星(EPOCH)等方案，雖取得了一定的療效，但腫瘤易耐藥，緩解期短。吉西他濱是阿糖胞苷的衍生物，屬于細(xì)胞周期特異性藥物，目前廣泛應(yīng)用于PTCL的治療，2008年NCCN指南將吉西他濱列入CTCL的二線系統(tǒng)治療中，但總的無進(jìn)展生存期或緩解期仍不理想〔1，4〕。

培美曲塞為多靶點葉酸拮抗劑，能抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶、甘氨酸核糖核苷甲?；D(zhuǎn)移酶等葉酸依賴性酶，廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療中。Chun等〔5〕報道培美曲塞能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，與吉西他濱聯(lián)合具有協(xié)同作用，且先用培美曲塞后用吉西他濱對細(xì)胞增殖的抑制作用更強。Tonkinson等〔6〕報道吉西他濱與培美曲塞聯(lián)合應(yīng)用于人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT29)存在時序效應(yīng)，先用培美曲塞后用吉西他濱對細(xì)胞增殖的抑制作用更強。Li等〔7〕研究埃羅替尼與培美曲塞聯(lián)合應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌，先用埃羅替尼后用培美曲塞，對埃羅替尼敏感的細(xì)胞產(chǎn)生拮抗作用;同時給藥或先用培美曲塞后用埃羅替尼，對埃羅替尼敏感或不敏感的細(xì)胞均產(chǎn)生協(xié)同作用。以上提示研究聯(lián)合培美曲塞抗腫瘤治療可能存在不同的時序效應(yīng)。

本研究提示吉西他濱與培美曲塞單藥以及不同時序聯(lián)合應(yīng)用均可抑制HUT-78增殖，促進(jìn)凋亡，作用大小與應(yīng)用時序有關(guān)，先用培美曲塞后再用吉西他濱的作用最強。

本實驗由于載體動物體內(nèi)實驗的復(fù)雜性，與體外細(xì)胞學(xué)實驗存在一定差異，而且CTCL是一組具有明顯異質(zhì)性的疾病，因此有必要此進(jìn)一步探討多種PTCL細(xì)胞株體內(nèi)外實驗研究，進(jìn)一步明確藥物作用機(jī)制、聯(lián)合用藥時序。

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