絞股藍(lán)總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

居立娟，王云東

（1.吉林市兒童醫(yī)院 兒內(nèi)科，吉林 吉林132001；2.北華大學(xué)第二臨床醫(yī)院·吉化總醫(yī)院 眼科）

絞股藍(lán)別名七葉膽、小芍藥云、羅鍋底、遍地生根等。其味苦、性寒，具有清熱解毒、祛痰止咳之功效。絞股藍(lán)的主要成分為絞股藍(lán)總皂苷（Gypenosides，GP）。近年來，人們對GP進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)其有廣泛的藥理作用，其中對心腦血管的研究引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，GP能夠保護(hù)心臟的缺氧性損傷，改善心肌缺血時心臟的舒張功能［1］，在一定程度上還能減輕甚至阻止心肌缺血所致心肌壞死，減少自由基的生成和鈣離子內(nèi)流［2－3］。GP能夠舒張血管，降低血壓，抑制血小板聚集，對氧自由基引起的腦血管痙攣具保護(hù)作用［4－6］。雖然絞股藍(lán)總皂苷對腦缺血損傷具有一定的保護(hù)作用，但是其作用機(jī)制方面的研究資料報道較少。

本文通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，研究絞股藍(lán)總皂苷對腦缺氧性損傷的保護(hù)作用并探討其機(jī)制，為腦缺血的預(yù)防提供新的思路，同時也為開發(fā)抗腦缺血新藥提供有價值的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物

絞股藍(lán)總皂苷購于西安鴻生生物技術(shù)有限公司；H2O2購于北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；SOD、MDA檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；Bcl－2、Bax大鼠多克隆抗體購于美國Santa Crnz公司；DAB檢測試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 動物分組及給藥

60只雄性Wistar大鼠，體重200－250g，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只，即假手術(shù)組、模型組、血塞通陽性藥組（20mg·kg－1）、絞股藍(lán)總皂苷高、中、低劑量組（100、30和10mg·kg－1）。每天腹腔注射（ip）給藥1次（前兩組為相同體積的生理鹽水），連續(xù)給藥7天。

1.3 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立

末次給藥30min后，模型組、陽性藥組及受試藥各劑量組用20%水合氯醛麻醉，分離右側(cè)頸總動脈和頸內(nèi)、頸外動脈，頸總動脈剪口后將一段一端加熱變鈍的3.5號魚線插入頸內(nèi)動脈并推入至前腦動脈約18mm（自頸內(nèi)外動脈分叉處算起），用縫合線結(jié)扎固定尼龍線，縫合皮膚。術(shù)后2h出現(xiàn)豎毛，右眼horner＇s征，左側(cè)偏癱的大鼠為陽性，2h后進(jìn)行缺血再灌注。假手術(shù)組只對頸內(nèi)和頸外動脈進(jìn)行分離，不結(jié)扎。

1.4 大鼠神經(jīng)功能評分的測定

大鼠腦缺血再灌注22h后進(jìn)行行為神經(jīng)功能評分，標(biāo)準(zhǔn)為：活動正常者為0分；豎毛，輕度運動低下者為0.5分；前肢屈曲運動障礙者為1.0分；行動不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢，轉(zhuǎn)圈運動者為2.0分；偏癱，不能行走者為3.0分；昏迷者為4.0分；死亡者為5.0分（術(shù)后2h以上死亡者）；運動障礙越明顯者得分越高。

1.5 腦組織勻漿中SOD、MDA及NO含量測定

實驗結(jié)束后，將大鼠立即斷頭取腦取血。取大約0.1g的腦組織制成均漿。SOD、MDA、NO的檢測按照試劑盒說明書操作，分別在550nm、532nm和340nm處，用6010紫外分光光度計檢測。

1.6 腦梗死范圍的測定

實驗結(jié)束后，將大鼠立即斷頭取腦，將腦組織進(jìn)行冠狀切片，間隔4mm共5片，放入2%TTC磷酸鹽緩沖液（pH7.4）37℃水浴10min，缺血缺氧壞死的神經(jīng)細(xì)胞因細(xì)胞膜損傷而導(dǎo)致脫氫酶缺失所以不染色，呈現(xiàn)白色，而非壞死的神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)鮮紅色。腦組織拍片后，應(yīng)用BI2000軟件計算，以白色區(qū)面積之和與腦組織總面積的百分比來計算腦梗死范圍。

1.7 HE染色

實驗結(jié)束后，將大鼠立即斷頭取腦，腦組織常規(guī)固定，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡（200×）下觀察，選取大腦中動脈供血區(qū)不重疊的3個視野攝片。

1.8 免疫組化染色檢測Bcl－2、Bax蛋白的表達(dá)

腦組織切片脫蠟和水化后，置于濕盒內(nèi)，滴加50μl過氧化物酶阻斷液（試劑A），室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3 min×2，滴加50μl非免疫動物血清（試劑B）室溫孵育10min，PBS沖洗3min×2，去除血清，滴加50 μl一抗（兔抗大鼠Bcl－2、Bax多克隆抗體，1：100稀釋）4℃過夜，PBS沖洗3min×3，滴加50μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔多克隆抗體，試劑C）室溫孵育10min，PBS沖洗3min×2，滴加50μl DAB，顯微鏡下觀察3－10min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察細(xì)胞漿中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，每個標(biāo)本在高倍鏡下（400×）觀察不重疊的2個視野，采用HPIAS－1000型圖像分析儀計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.9 結(jié)果處理和統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，應(yīng)用SPSS11.5版統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理。各組間比較采用單因素方差分析，成組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，百分?jǐn)?shù)的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)總皂苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分明顯升高（P＜0.01），說明模型成立；與模型組比較，絞股藍(lán)總皂苷100mg·kg－1、30mg·kg－1劑量組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低（P＜0.05）與陽性對照藥血塞通組作用相近；而絞股藍(lán)總皂苷10 mg·kg－1劑量組大鼠神經(jīng)功能評分與模型組比較差異無顯著性（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 絞股藍(lán)總皂苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響

2.2 絞股藍(lán)總皂苷對大鼠腦組織中SOD及MDA、NO含量的影響

與模型組比較，絞股藍(lán)總皂苷100和30mg·kg－1劑量組大鼠腦組織中SOD活性明顯增強(qiáng)，MDA含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01﹚；絞股藍(lán)總皂苷10mg·kg－1劑量組SOD活性，MDA含量也分別有增強(qiáng)及下降趨勢，但差異無顯著性﹙P＞0.05﹚；絞股藍(lán)總皂苷各劑量組大鼠腦組織中NO含量均有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見圖1。

圖1 絞股藍(lán)總皂苷對大鼠腦組織中SOD，MDA和NO含量的影響

2.3 絞股藍(lán)總皂苷對大鼠腦梗死面積的影響

模型組大鼠的腦梗死范圍為（43.18±3.52）%明顯高于假手術(shù)組（P＜0.001）；而絞股藍(lán)總皂苷100和30mg·kg－1劑量組大鼠的腦梗死范圍分別為（30.57±4.15）%、（35.84±3.84）%均明顯低于模型組（P＜0.05），其中100mg·kg－1劑量組大鼠的腦梗死范圍與陽性對照藥血塞通組相近；絞股藍(lán)總皂苷10mg·kg－1劑量組大鼠的腦梗死范圍與模型組比較差異無顯著性（P＞0.05），結(jié)果見表2。

表2 絞股藍(lán)總皂苷對大鼠腦梗死面積的影響（n＝10，±s）

表2 絞股藍(lán)總皂苷對大鼠腦梗死面積的影響（n＝10，±s）

與模型組比較＊＊P＜0.01，＊P＜0.05；與假手術(shù)組比較＋＋P＜0.001

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2.4 HE染色結(jié)果

光鏡下假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞體呈圓形，胞核規(guī)整，染色質(zhì)分布均勻，胞膜完整，胞質(zhì)無明顯嗜伊紅染色；模型組變性壞死的神經(jīng)元主要分布在大腦皮層，缺血壞死區(qū)腦組織水腫、疏松，可見大量神經(jīng)元胞體為三角形，核固縮，核溶解，核仁消失，胞質(zhì)嗜伊紅染色，細(xì)胞周圍間隙增寬，水腫空泡形成，神經(jīng)元間隙擴(kuò)大；絞股藍(lán)總皂苷100mg·kg－1劑量組可見腦皮質(zhì)局限性壞死灶，區(qū)域內(nèi)腦組織結(jié)構(gòu)水腫，疏松，可見少量神經(jīng)元胞體呈三角形，胞質(zhì)嗜伊紅染色；陽性對照藥血塞通組病理改變與絞股藍(lán)總皂苷高劑量組相近；絞股藍(lán)總30mg·kg－1劑量組較多神經(jīng)元胞體呈三角形，胞質(zhì)嗜伊紅染色；絞股藍(lán)總皂苷10mg·kg－1劑量組腦皮質(zhì)區(qū)可見局限性壞死灶，神經(jīng)元胞體呈三角形，胞質(zhì)嗜伊紅染色，結(jié)果見圖2。

圖2 絞股藍(lán)總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織HE染色的影響 （200×）

2.5 免疫組化染色結(jié)果

結(jié)果顯示，光鏡下觀察細(xì)胞漿中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，結(jié)果見表3。

表3 用免疫組化方法檢測絞股藍(lán)總皂苷對Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)的影響（n＝10，±s）

表3 用免疫組化方法檢測絞股藍(lán)總皂苷對Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)的影響（n＝10，±s）

與模型組比較＊＊P＜0.001，＊P＜0.05；與假手術(shù)組比較＋＋P＜0.001

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3 討論

大腦的正常功能活動依賴于血液的供應(yīng)，當(dāng)腦組織缺血時，會損傷神經(jīng)細(xì)胞的功能，甚至造成不可逆的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，腦組織在缺氧或缺血性損傷時能夠產(chǎn)生大量的氧自由基。神經(jīng)細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)因自由基的影響而遭到破壞，引起脂質(zhì)過氧化，線粒體功能喪失、溶酶體破裂、以及組織水腫等一系列損害作用。SOD具有清除超氧陰離子，保護(hù)細(xì)胞膜，抗氧化等作用［7］。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中的代謝產(chǎn)物，通過檢測 MDA含量可以預(yù)知機(jī)體中自由基的含量及自由基造成的損傷程度［8］。NO是一種新型自由基，腦缺血時大量產(chǎn)生將引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA損傷的氧化應(yīng)激，最終造成神經(jīng)細(xì)胞死亡。

本實驗結(jié)果顯示，絞股藍(lán)總皂苷可使腦缺血再灌注大鼠的行為指標(biāo)評分明顯降低，腦組織勻漿中SOD水平升高，MDA及NO的含量降低，減少腦梗死面積，形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，絞股藍(lán)總皂苷能夠減輕腦組織水腫，改善神經(jīng)細(xì)胞損傷，使空泡減少，表明絞股藍(lán)總皂苷可減輕腦缺血再灌注所造成的損傷，改善腦功能。

Bcl－2蛋白及其家族成員通過一個非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控細(xì)胞的凋亡。Bcl－2蛋白家族分為2類：一類是抗凋亡的蛋白，包括Bcl－2、Bcl－w、Bcl－xL；另一類是促進(jìn)凋亡的蛋白，主要有Bax、Bad、Bak。Bcl－2蛋白可作為氧化劑調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，通過減少氧自由基的產(chǎn)生，減少Ca2＋的釋放，維持Ca2＋的穩(wěn)定而對抗細(xì)胞的凋亡。Bax蛋白在受到凋亡信號刺激時其構(gòu)象會發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，從而引起凋亡，所以Bcl－2／Bax比值高，細(xì)胞存活率高，比值低，細(xì)胞凋亡率高［9－10］。

本實驗結(jié)果顯示，假手術(shù)組可見Bcl－2表達(dá)的陽性細(xì)胞和少量的Bax表達(dá)的陽性細(xì)胞；模型組Bcl－2蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著低于假手術(shù)組，Bax蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著高于假手術(shù)組。而絞股藍(lán)總皂苷各組Bcl－2蛋白表達(dá)明顯高于模型組，Bax蛋白表達(dá)明顯低于模型組，因而Bcl－2／Bax二者比例提高，說明絞股藍(lán)總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是通過在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平調(diào)節(jié)Bcl－2和Bax的表達(dá)實現(xiàn)。本實驗結(jié)果將為臨床腦缺血患者的治療方面提供新思路，并為今后絞股藍(lán)總皂苷應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。

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