原發(fā)性肝癌患者尿8－羥基脫氧鳥苷水平的觀察

唐 毅，李辛平，唐振勇，劉麗麗，唐耘天＊

（1.廣西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院本碩062班，廣西 南寧530021；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 肝膽外科，廣西 南寧530021；3.廣西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院本碩074班 ，廣西 南寧530021）

原發(fā)性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預后差。我國是肝癌大國，全球50%以上的肝癌病例發(fā)生在我國，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢［1］。但迄今為止，其確切的發(fā)病機制尚未明了。有研究顯示：DNA氧化損傷的主要產物8－羥基脫氧鳥苷（8－OHdG）在體內的長期積累會增加自發(fā)性突變率，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關聯［2］。本研究通過ELISA檢測法測定肝癌患者的尿8－OHdG水平，并與健康體檢者進行比較，以探討氧化損傷在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗組：選擇廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科2011年8月至2012年10月期間收治的男性肝癌患者100例，年齡21－74歲，平均年齡為49.24±10.36歲。所有患者無嚴重心、肺和腎等重要臟器的急慢性疾病史，均經過術后病理學檢查或經皮穿刺活檢確診為原發(fā)性肝細胞性肝癌；對照組：該院門診男性健康體檢者100例，年齡25－65歲，平均年齡為48.60±9.93歲。兩組研究對象的一般資料經過統(tǒng)計學分析比較，無明顯差異。

1.2 標本采集 采集肝癌患者以及健康體檢者清晨中段尿，留取量各約10ml。標本不加任何防腐劑，采集后立即轉移至－80℃冰箱中冷凍保存待用。

1.3 主要試劑和儀器 人8－OHdG單克隆抗體試劑盒以及人肌酐ELISA試劑盒均由BlueGene Biotech公司提供，主要儀器為酶聯免疫監(jiān)測儀（型號GF－M3000，購于山東高密彩虹分析儀器有限公司）。

1.4 尿8－OHdG檢測方法 將尿樣室溫解凍，震蕩混勻后離心15min（3 000r／min），取上清100μl。以ELISA法嚴格按試劑盒說明書操作檢測尿8－OHdG。由于尿中的8－OHdG受尿濃縮程度的影響，最終數值采用尿肌酐（creatine，Cr）值較正，單位為（8－OHdG）ng／mgCr。尿肌酐亦采用 ELISA 法檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，各項數據以均數±標準差（±s）表示，肝癌組與實驗組間相對表達水平的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 8－OHdG標準曲線的制作 取8－OHdG標準液（0、10、25、50、100、250ng／mL）和空白對照（蒸餾水），采用相同測定方法用酶標儀測定光吸收值。以450nm下吸光度值為縱坐標，以8－OHdG含量（ng／ml）的對數值為橫坐標，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 ELISA方法測定8－OHdG含量的標準曲線

2.2 尿8－OHdG的檢測 根據各尿樣本在450nm下的吸光度值，結合8－OHdG含量的標準曲線，計算肝癌患者（HCC）和健康對照組尿8－OHdG的含量。經t檢驗，肝癌患者和健康體檢者兩組人群尿8－OHdG水平比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 肝癌患者和健康體檢者尿8－OHdG水平的比較

3 討論

8－OHdG 是活性自由基（reactive oxygen species，ROS）攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產生的一種氧化性加合物，由于其為代謝終產物，具有形成途經單一、在體內穩(wěn)定、易于檢測等優(yōu)點，目前已成為評價機體內DNA氧化損傷水平的最常用的生物標志物。8－OHdG產生后無需進一步代謝而經腎臟排泄，其在尿中的含量不受飲食等因素影響，因此尿8－OHdG的含量可以反映機體氧化損傷的程度。既往研究證實，8－OHdG具有突變性，可以在DNA復制時引起G：C→T：A的顛換而導致點突變［3］。8－OHdG異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，并且與很多惡性腫瘤的預后有相關性［4－8］。肝癌是常見的惡性腫瘤，其確切發(fā)病機制目前尚未被闡明。肝炎病毒感染、黃曲霉毒素污染、飲酒等暴露是肝癌發(fā)病的高危因素，其可引起肝細胞DNA氧化損傷，使損傷累積導致細胞惡性轉化，并被認為此為肝癌的發(fā)病重要機制［9］。

研究表明，體內8－OHdG水平與年齡、性別、吸煙、劇烈運動、職業(yè)暴露、輻射以及糖尿病、腫瘤、心血管疾病等多因素有關［10－15］。本研究對象入組時嚴格排除了上述因素的影響，通過ELISA法檢測肝癌患者尿8－OHdG的含量以研究DNA氧化損傷與肝癌發(fā)生發(fā)展的關系。具有：標本采集簡單、無創(chuàng)傷、易于保存、檢測指標穩(wěn)定性強；檢測方法對實驗儀器的要求低；所需時間少、試樣的制備簡單、分析所需樣品量少等諸多優(yōu)點［16］?？勺鳛橐环N大量人群中的肝癌普查篩查工具，該方法具有推廣的可能性。

本研究結果顯示：健康體檢者尿8－OHdG的含量為12.21±4.51ng／mgCr，與其他研究結果接近［11，17，18］。肝癌患者尿8－OHdG的含量為16.12±5.30ng／mgCr，顯著高于健康體檢者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這與已有的文獻報導結果相一致［17］。故本研究的結論為，DNA氧化損傷水平與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有密切的關系，測定尿8－OHdG的含量有助于肝癌的早期診斷，該方法有望成為肝癌篩查與診斷的新工具。

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