基于UPLC－TOF－MS分析人參麥冬配伍后皂苷類成分的變化

周思思，馬增春，梁乾德，湯響林，王宇光，譚洪玲，肖成榮，張伯禮，高 月

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850；2.安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，安徽 合肥 230032；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

中醫(yī)臨床用藥多采用復(fù)方形式，方劑是在辨證審因決定治法之后，選擇合適的藥物，酌定用量，按照組方結(jié)構(gòu)的要求，妥善配伍而成的?！八幱袀€(gè)性之專長(zhǎng)，方有合群之妙用”。臨床單用人參，可直接發(fā)揮補(bǔ)氣健脾、補(bǔ)氣益肺、補(bǔ)氣養(yǎng)心、補(bǔ)氣生津、大補(bǔ)元?dú)獾裙π?，通過與其他藥物相配，能使某一方面的直接功效更為突出［1］。人參與麥冬相配，人參乃補(bǔ)氣圣藥，兼有生津之功；麥冬乃滋陰要藥，亦有扶正之力［2］。合用則補(bǔ)氣養(yǎng)陰之功大增。人參與麥冬相配亦有氣充津足脈復(fù)之效，故《景岳全書》言麥冬復(fù)脈須仗人參。

人參皂苷是人參所含的最為重要的一類生理活性物質(zhì)，約占人參組成的3%［3］。目前從人參植物中至少分離提取出80多種人參皂苷單體，按硅膠薄層色譜Rf值的大小順序，由小到大命名為 Ro，Ra，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Re，Rf，Rgl，Rg2，Rg3，Rh1，Rh2等。人參皂苷按苷元的結(jié)構(gòu)可分為3類:齊墩果酸型（如人參皂苷Ro），人參二醇型（如人參皂苷Rb1），人參三醇型（如人參皂苷 Rg1）［4－6］。人參含有多種化學(xué)成分，且其作用各不相同，甚至在有些方面截然相反。有些成分的作用是專一的，其它成分則不產(chǎn)生該作用［7－8］。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC－TOF－MS）技術(shù)，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squared discriminant analysis，OPLS－DA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，探討人參麥冬配伍后對(duì)人參皂苷的影響，試圖從人參皂苷成分變化的角度闡述二者配伍應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲酸（分析純）:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純）:美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；麥冬（批號(hào)20110917，產(chǎn)地浙江慈溪）、人參（批號(hào)20110901，產(chǎn)地吉林）、標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷Rb2，Rc，Rd （批 號(hào) 20110624、20110527、20110505）:購自中國藥品生物制品檢定所。

Acquity UPLC－Synapt MS色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國 Waters公司產(chǎn)品，配有 MassLynx V 4.1質(zhì)譜工作站，Acquity HSS T3色譜柱（100 mm×2.1mm×1.8μm），色譜柱冷凍離心機(jī)（Heraeus Labofuge 400R）。

1.2 樣品制備

按V（人參）∶V（麥冬）＝1∶1比例稱重混合，加入8倍量的水，浸泡30min后煎煮，煮沸60min，提取煎液，3層紗布過濾；第二次煎煮加入5倍量水，煎煮30min后，紗布過濾，提取煎液，合并兩次濾液，即為人參麥冬合煎液；先制備人參單煎液和麥冬單煎液，制備方法同上，將兩煎液按1∶1混合，即為人參麥冬合并液。將制備的煎液靜置，以13000r／min離心10min，取上清液，0.22μm微孔濾膜過濾即為樣品，重復(fù)以上所有步驟8次，將所有樣品4℃保存，待測(cè)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取1mg人參皂苷Rb1于10mL V（乙腈）∶V（水）＝1∶1的溶液里，即為人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同法制備人參皂苷Rc和人參皂苷Rd的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4 超高效液相色譜條件

采用Acquity BEH C18色譜柱（100mm×2.1mm×1.7μm）；柱 溫 45 ℃，流 速 0.45 mL／min，進(jìn)樣量5μL；流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈溶液；梯度洗脫（0→2min:25%B；2→3min:25%→30%B；3→17min:30%→35%B；17→19min:35%→25%B；19→20min:25%B）［9－10］。

1.5 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離離子源（ESI），正離子V模式檢測(cè)，檢測(cè)范圍m／z 70～1000，毛細(xì)管電壓2.9kV，錐孔電壓40V，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度450℃，脫溶劑氣體流速900L／h，錐孔氣 流 量 50L／h，質(zhì) 量 校 正 質(zhì) 荷 比 m／z 556.2771；負(fù)離子V模式檢測(cè)，檢測(cè)范圍m／z 70～1500，毛細(xì)管電壓3kV，錐孔電壓40V，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度450℃，脫溶劑氣體流速900L／h，錐孔氣流量50L／h，質(zhì)量校正質(zhì)荷比 m／z554.2615［11－12］。

1.6 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用 MassLynx 4.1軟件進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊及歸一化等處理，找出人參與麥冬合煎液與合并液中20種人參皂苷。首先利用MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站中的PCA功能，對(duì)人參麥冬合煎液與合并液中的所有分子離子峰進(jìn)行比較，然后利用pareto算法更精確計(jì)算出兩組之間差異顯著的分子離子峰，通過PLS－DA計(jì)算分析，然后通過散點(diǎn)圖S－Plot找出人參麥冬藥對(duì)配伍后變化顯著的8種人參皂苷，結(jié)合文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)室MassLynx工作站Exact Mass Search（EMS）軟件質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，對(duì)潛在的化學(xué)標(biāo)記物進(jìn)行鑒定［13－14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC－TOF－MS結(jié)果

比較人參麥冬合并液、人參麥冬合煎液的負(fù)離子流圖，示于圖1，即人參與麥冬藥對(duì)合并液與合煎液負(fù)離子模式下的離子流圖。對(duì)應(yīng)圖1中1～20號(hào)峰，根據(jù)本體結(jié)構(gòu)的不同，其中原人參二醇型人參皂苷包括9，10，11，13，14，15，16，17，18，19號(hào)峰，分別為人參皂苷Ra2，人參皂苷Rb1，丙二酸甲?；藚⒃碥誖b1，人參皂苷Rc，人參皂苷Ra1，丙二酸甲酰基人參皂苷Rc，人參皂苷Rb2，人參皂苷Rb3，丙二酸甲?；藚⒃碥誖b2，人參皂苷Rd。原人參三醇型人參皂苷包括1，3，4，5，6，7，8號(hào)峰，分別為20－葡萄糖基人參皂苷Rf，人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rf，人參皂苷F3，20（R）－人參皂苷 Rg2，人參皂苷F2。齊墩果型人參皂苷為12峰，為人參皂苷Ro，另外還有2號(hào)峰三七皂苷R1。

圖1 人參與麥冬藥對(duì)合并液（a）與合煎液（b）負(fù)離子模式下的離子流圖Fig.1 The chromatograms of mixed－decoction（a）and co－decoction（b）of giseng and ophiopogonis in negative ion mode

2.2 人參皂苷同分異構(gòu)體的定性結(jié)果

人參皂苷根據(jù)主體結(jié)構(gòu)主要分為3種:二醇型人參皂苷、三醇型人參皂苷和齊墩果型人參皂苷，人參皂苷的結(jié)構(gòu)決定了人參皂苷能形成多種同分異構(gòu)體，示于圖2。比如m／z 1077.5846的人參皂苷有3個(gè)同分異構(gòu)體，分別為人參皂苷Rb2、Rb3、Rc；m／z 991.5478的同分異構(gòu)體有人參皂苷Re、Rd；m／z 1209.5904的同分異構(gòu)體有人參皂苷Ra1、Ra2。

如圖3所示，進(jìn)行人參皂苷Rb2、Rc的標(biāo)準(zhǔn)品確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb2在8.93min出峰，人參皂苷Rc在7.66min出峰，且標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定精確度均小于百萬分之五，因此另一峰即為人參皂苷Rb3，可以確定此3種人參皂苷的出峰順序是Rc＞Rb2＞Rb3。同樣對(duì)m／z 991.5478的同分異構(gòu)體人參皂苷Re、Rd進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的確認(rèn)，確定兩種人參皂苷的出峰順序是Re＞Rd。對(duì)于m／z1209.5904的同分異構(gòu)體人參皂苷Ra1、Ra2，查 閱 文 獻(xiàn)［4－5］，確 定 其 出 峰 順 序 為Ra2＞Ra1。

圖2 二醇型人參皂苷，三醇型人參皂苷和齊墩果型人參皂苷的結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The structure of protopanaxadiol type ginsenoside，protopanaxatriol type ginsenoside and oleanolic acid ginsenoside

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊及歸一化等處理，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品確認(rèn)與本實(shí)驗(yàn)室的MassLynx工作站Exact Mass Search（EMS）軟件質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫找出人參與麥冬合煎與合并液中20種人參皂苷。結(jié)合圖1，整理的結(jié)果列于表1，20種人參皂苷的質(zhì)量精確度都小于4×10－6。與本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的流動(dòng)相梯度相符，極性大的先出峰，在8號(hào)峰之前的化合物基本是原三醇型人參皂苷，相反之后的峰基本是原二醇型人參皂苷。

表1 人參麥冬藥對(duì)合并液與合煎液的皂苷類成分的鑒別Table 1 Ginsenoside identified from decoctions of ginseng and radix ophiopogonis

2.3 MarkerLynx統(tǒng)計(jì)結(jié)果

MarkerLynx 4.1統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果示于圖4～6。由圖4即主成分分析圖PCA可見，兩組樣品能夠得到明顯的區(qū)分，也就是說兩組樣品具有差異明顯的標(biāo)志物。進(jìn)一步由圖5人參麥冬藥對(duì)合并液與合煎液負(fù)離子模式下正交偏最小二乘法差異成分的S曲線可見，合煎液與合并液之間差異顯著的分子離子峰分布在S曲線的兩端，S曲線的左下角代表了合煎液與合并液相比差異顯著的分子離子峰，S曲線的右下角代表了合并液與合煎液相比差異顯著的分子離子峰，而差異的分子離子峰代表了特征性的化學(xué)成分，即兩組樣品在化學(xué)成分上的差異性。因此，a、b、c、d點(diǎn)代表了合煎液與合并液相比差異顯著的化學(xué)成分，而e、f、g、h點(diǎn)代表了合并液與合煎液相比差異顯著的化學(xué)成分。

人參麥冬藥對(duì)合并液與合煎液負(fù)離子模式下差異成分S曲線中有代表性的化合物示于圖6。在合煎液中，人參皂苷Rb3、丙二酸甲?；藚⒃碥誖b2、丙二酸甲?；藚⒃碥誖c、人參皂苷Rf含量增高；在合并液中，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、丙二酸甲酰基人參皂苷Rb1含量增高。

圖4 人參麥冬藥對(duì)合并液與合煎液負(fù)離子模式下主成分分析圖Fig.4 PCA／Scores plot of co－decoction and mixed－decoction of ginseng and radix ophiopogonis obtained using Pareto scaling with mean centering

圖5 人參麥冬藥對(duì)合并液與合煎液負(fù)離子模式下正交偏最小二乘法差異成分的S曲線Fig.5 OPLS－DA／S－Plot of co－decoction and mixed－decoction of ginseng and radix ophiopogonis obtained using Pareto scaling with mean centering

3 結(jié)論

藥物的功用各有所長(zhǎng)，也各有所短，只有通過合理的組織，使各具特性的群藥組合成一個(gè)新的有機(jī)整體，從而符合辨證論治的要求。人參皂苷是人參所含的最為重要的一類生理活性物質(zhì)，約占人參組成的3%。人參皂苷按苷元的結(jié)構(gòu)可分為3類:齊墩果酸型，主要有抗炎、抗血小板作用［15］；原人參二醇型，主要作用表現(xiàn)為中樞神經(jīng)抑制和改善心肌缺血再灌注損傷等［16］；人參三醇型，表現(xiàn)為中樞神經(jīng)興奮作用［17］。對(duì)9種人參皂苷抗大鼠心律失?；钚匝芯勘砻?，其活性強(qiáng)度順序?yàn)?人參三醇型＞齊墩果酸型＞人參二醇型［18］。人參中三醇型皂苷表現(xiàn)較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用［19－20］。

圖6 人參麥冬藥對(duì)合并液與合煎液負(fù)離子模式下差異成分S曲線中有代表性的化合物Fig.6 Selected ion intensity trend plots of mixed－decoction and co－decoction of ginseng and radix ophiopogonis obtained using Pareto scaling with mean centering monitored in negative ion mode

采用UPLC－TOF－MS技術(shù)獲得人參麥冬藥對(duì)合并液與合煎液的指紋圖譜，采集含有精確質(zhì)量測(cè)定的原始數(shù)據(jù)，當(dāng)將這些數(shù)據(jù)作為精確質(zhì)量保留時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)轉(zhuǎn)成二維矩陣形式，采用多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法即可對(duì)這套數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果可以導(dǎo)回Markerlynx的結(jié)果列表中，再通過精確分子質(zhì)量與保留時(shí)間在數(shù)據(jù)庫中檢索，確定合并液與合煎液的差異成分。研究結(jié)果表明:在合煎液中，人參皂苷Rb3、丙二酸甲?；藚⒃碥誖b2、丙二酸甲?；藚⒃碥誖c、人參皂苷Rf含量增高；而人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、丙二酸甲?；藚⒃碥誖b1含量減少。這說明人參與麥冬配伍后，人參三醇型人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的含量降低，人參二醇型人參皂苷Rb3的含量升高，即人參配伍麥冬可起到增效減毒的作用。

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