高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物源食品中硝呋索爾代謝物殘留

黃 帆，王傳現(xiàn)，張 縉，盛永剛，王 敏，韓 麗，李曉虹，徐敦明，劉 茜，丁卓平

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；3.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 廈門 361026）

硝基呋喃類抗生素是一類人工合成的具有5－硝基結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，包括眾所周知的呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因，該類藥物也是一類具有潛在致癌和誘導(dǎo)有機(jī)體產(chǎn)生突變的物質(zhì)。硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝速度快，半衰期短，一般為幾個(gè)小時(shí)，因此，對(duì)動(dòng)物組織中硝基呋喃母體藥物的準(zhǔn)確檢測(cè)是比較困難的，對(duì)硝基呋喃類藥物的殘留量測(cè)定也是不準(zhǔn)確的。但通過對(duì)硝基呋喃類藥物進(jìn)行同位素標(biāo)記的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其代謝產(chǎn)物能夠與組織蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)合物，在動(dòng)物組織體內(nèi)殘留較長(zhǎng)時(shí)間，并通過水解從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)。因此，硝基呋喃類藥物的真實(shí)殘留狀況可利用檢測(cè)其代謝物體現(xiàn)［1－3］。

歐盟于1995年發(fā)布指令要求此類藥物不再允許使用在食用動(dòng)物身上。硝呋索爾（nifursol）也屬于硝基呋喃類藥物（nitrofurans），被歐盟1756／2002／EC禁用。但是，無(wú)論在科研還是標(biāo)準(zhǔn)制定方面，國(guó)內(nèi)尚未有測(cè)定硝呋索爾代謝物殘留的文獻(xiàn)報(bào)道，因而加快對(duì)硝呋索爾代謝物殘留的檢測(cè)研究，對(duì)保證食品安全具有十分重要的意義。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有分光光度法［4］、高效液相色 譜 法［5－8］、液 質(zhì) 聯(lián) 用 分 析 法［9－10］和 免 疫 分 析法［11－12］等。張會(huì)彩 等［8］利 用 高 效 液 相 色 譜 法 檢測(cè)飼料中含硝呋索爾在內(nèi)的7種硝基呋喃類藥物，該法對(duì)飼料中7種藥物的檢測(cè)限均小于32 μg／kg。國(guó)外學(xué)者對(duì)硝呋索爾代謝物殘留的研究多采用液質(zhì)聯(lián)用分析法，如Verdon等［13］建立了同時(shí)檢測(cè)5種硝基呋喃代謝物的多殘留監(jiān)控的液質(zhì)聯(lián)用法；Kaufmann等［14］建立了包括硝呋索爾在內(nèi)的5種硝基呋喃藥物的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法；Zuidema等［2］利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了硝呋索爾在肉雞中的代謝及降解，并建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)肉雞的不同部位殘留的硝呋索爾及其代謝產(chǎn)物3，5－二硝基水楊酸肼（DNSH）檢測(cè)。

質(zhì)譜檢測(cè)器具有定性定量準(zhǔn)確、檢測(cè)限低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，本研究采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)腸衣、魚、蝦等基質(zhì)中硝呋索爾代謝物的殘留量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

LC－20ADXR高效液相色譜儀:日本Shimadzu公司產(chǎn)品；API 4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國(guó)AB公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源；Allegra X－22R高速離心機(jī):美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；N－EVAP111型氮吹濃縮儀:美國(guó)Organomatian公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙腈、甲酸（色譜純）:美國(guó)J.T.Baker公司產(chǎn)品；二甲亞砜（色譜純）、2－硝基苯甲醛（2－NBA）（純度＞98%）:美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水為 Milli－Q超純水；3，5－二硝基水楊酸肼（純度＞99%）:俄羅斯vitas－M公司產(chǎn)品；硝呋奇特內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）:德國(guó) Witega公司產(chǎn)品。儲(chǔ)備液:甲醇配制，濃度為0.1g／L，貯存在0～4℃冰箱中，根據(jù)需要用甲醇稀釋至適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液；衍生劑:稱取75.5mg 2－硝基苯甲醛，并溶解于10mL二甲亞砜中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 Thermo Aquasil C18色譜柱（150mm×4.6mm×3.0μm）；流動(dòng)相 A為含1‰甲酸的乙腈、B為含1‰甲酸的5mmol／L乙酸銨溶液；流速0.6mL／min；進(jìn)樣體積20μL；柱溫:常溫。梯度洗脫程序列于表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化負(fù)離子模式（ESI－）；電噴霧電壓（IS）:－4500V；霧化氣壓力（GS1）:483kPa；氣 簾 氣 壓 力 （CUR）:241 kPa；輔助氣壓力（GS2）:414kPa；離子源溫度:550℃。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)和去簇電壓（DP），聚焦電壓（FP），碰撞氣能量（CE）及碰撞室出口電壓（CXP），列于表2。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的水解及衍生化 稱取1.00g試樣于50mL塑料離心管中，依次加入10mL水，0.5mL鹽酸溶液和500μL衍生劑溶液，混勻后置于37℃恒溫振蕩器中保持16h。

1.4.2 樣品的提取和凈化 將上述衍生好的溶液取出后，加入5mL 0.1mol／L磷酸氫二鈉溶液，用300μL 1.0mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5，再在該中性溶液中加入2.0g中性氧化鋁，搖勻1min，以4000r／min離心3min，上層清液轉(zhuǎn)移至裝有16mL乙酸乙酯的塑料離心管中，充分混勻5min后，以4000r／min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)移至20mL氮吹管中，再加入10mL乙酸乙酯重復(fù)提取，經(jīng)上述步驟后，合并提取液，提取液在40℃下氮?dú)獯蹈桑淮蹈珊?，在氮吹管中加?mL V（乙腈）∶V（1‰甲酸水）＝2∶8的溶液定容，2mL乙腈飽和的正己烷去脂，充分混勻后，下層溶液轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，以16000r／min離心5min，上清液過0.2μm濾膜后，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

與其他4種硝基呋喃類代謝物3－氨基－2－惡唑烷酮（AOZ）、3－氨基－5－嗎啉甲基－2－惡唑烷酮（AMOZ）、1－氨 基 乙 內(nèi) 酰 脲 （AHD）、氨 基 脲（SEM）一樣，DNSH以蛋白結(jié)合物的形態(tài)存在于樣品組織中，在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下釋放出來(lái)。同時(shí)DNSH的分子質(zhì)量較小，不易產(chǎn)生具有典型特征的離子碎片，檢測(cè)靈敏度低，因此，需要對(duì)其進(jìn)行衍生化。目前對(duì)硝基呋喃類代謝物采用最多的衍生化試劑是2－硝基苯甲醛（2－NBA），故本研究選用2－NBA作為衍生化試劑，對(duì)水解游離出來(lái)DNSH的自由氨基進(jìn)行衍生化，形成的衍生化產(chǎn)物具有更好的質(zhì)譜特性，其衍生化反應(yīng)示于圖1。參照文獻(xiàn)［15］方法，對(duì)食品中的DNSH進(jìn)行了同步水解和衍生化。2－NBA配制的溶劑一般為二甲亞砜和甲醇，本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種溶劑進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用甲醇配制的衍生劑溶液，其衍生物質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度較二甲亞砜低，且背景干擾相對(duì)大，因此，選擇二甲亞砜配制2－NBA衍生化試劑。

圖1 DNSH與2－硝基苯甲醛的衍生化反應(yīng)Fig.1 Derivatizing reaction leading to the nitrophenyl derivative of DNSH

樣品凈化的方法主要有液液萃取［16－17］和固相萃取法［18－19］。固相萃取法操作較為繁瑣，成本較高，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯液液萃取。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯液液萃取法適用于大多數(shù)的復(fù)合型基質(zhì)，其操作較為簡(jiǎn)單，且成本低廉。為了防止乳化，可在提取之前離心后除去固體樣品，利于凈化。對(duì)于蝦仁、魚等含脂量高的樣品，也可通過提高離心轉(zhuǎn)速，降低乳化，提高回收率［20］。由于乙酸乙酯對(duì)水中脂類物質(zhì)也有一定的提取，在濃縮定容后，采用正己烷去脂，高速離心法，可有效去除雜質(zhì)。

同時(shí)，還考察了中性氧化鋁的加入順序?qū)μ崛『蛢艋Ч挠绊?。加入中性氧化鋁能吸附樣品中的脂肪，有利于凈化步驟提取更完全，其一是將中性氧化鋁加入到調(diào)好pH值的溶液中；其二是為了防止樣品中的脂肪對(duì)衍生化效率有影響，中性氧化鋁在樣品進(jìn)行衍生化時(shí)添加。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在衍生時(shí)加入中性氧化鋁，對(duì)衍生有一定的干擾，使衍生不完全，結(jié)果的重現(xiàn)性差，并且對(duì)水解時(shí)要求的酸性環(huán)境有影響。而第一種方式所得到的水溶液較為澄清，去脂效果明顯。因此，選擇在溶液調(diào)完pH值之后加入中性氧化鋁。

在進(jìn)行樣品提取時(shí)，衍生液的pH值對(duì)萃取效率有很大的影響。在陰性樣品水解衍生后，加入5mL 0.1mol／L磷酸氫二鈉溶液，用1.0 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)至不同pH值后測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值為7.0～7.5時(shí)，DNSH 的衍生產(chǎn)物測(cè)定響應(yīng)值最高。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)采用10mg／L DNSH以及水楊酰肼（SAH）標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行水解和衍生化處理，分別得到NPDNSH和NPSAH標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液。利用針泵分別以流動(dòng)注射的方式在電噴霧正／負(fù)模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定其分子離子，調(diào)節(jié)去簇電壓、射入電壓，使其豐度最大，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，固定去簇電壓、射入電壓，調(diào)節(jié)碰撞氣能量和碰撞室出口電壓，選擇二級(jí)質(zhì)譜中沒有干擾、信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)的3個(gè)特征碎片離子，與其母離子組成3對(duì)離子對(duì)，對(duì)該藥物進(jìn)行定性和定量分析，NPDNSH的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件列于表2。

圖2 NPDNSH的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS／MS spectra of NPDNSH

2.3 基質(zhì)效應(yīng)及內(nèi)標(biāo)物的選擇

采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行食品中藥物殘留檢測(cè)時(shí)，由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，導(dǎo)致目標(biāo)化合物發(fā)生離子增強(qiáng)或抑制作用，通過添加內(nèi)標(biāo)物和用空白樣品提取液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液兩種方式相結(jié)合，可以減弱離子化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，減少定量結(jié)果的偏差。在對(duì)DNSH進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，信號(hào)強(qiáng)度變化大，分析的準(zhǔn)確度低。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，DNSH的內(nèi)標(biāo)選擇用DNSH的類似物SAH代替，SAH是由另一種硝基呋喃類藥物硝呋奇特經(jīng)過水解獲得，所得離子信號(hào)能得到滿意的分析結(jié)果。

表2 DNSH和SAH的衍生物定性、定量離子對(duì)以及質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)表Table 2 Multiple reaction monitoring transition and mass spectrometry parameters of derivative compounds

2.4 線性范圍及檢出限

在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，以空白基質(zhì)溶液配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg／L的系列混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以內(nèi)標(biāo)法定量（50μg／L內(nèi)標(biāo)），以分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸。獲得的線性方程為y＝0.0613x－0.007，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9995。結(jié)果表明，在0.5～10μg／L范圍內(nèi)，定量離子的響應(yīng)峰面積和樣品質(zhì)量濃度之間有很好的線性關(guān)系。以3倍信噪比（S／N）計(jì)算DNSH的檢出限（LOD）為0.5μg／kg，以10倍信噪比（S／N）計(jì)算DNSH的定量限（LOQ）為1.0μg／kg。

2.5 添加回收實(shí)驗(yàn)

以不含DNSH殘留的蝦仁、豬肉、腸衣、魚為空白樣品，按前述方法進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)。在0.5、1.0、2.0、4.0μg／kg的添加水平下，DNSH 的回收率在 63.4% ～109.5%（n＝6）之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～11.9%（n＝6）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表3。

表3 不同添加水平下，4種動(dòng)物組織中DNSH的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of DNSH at four spiked levels in animal tissue samples（n＝6）

3 結(jié)論

采用液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物源食品基質(zhì)中的硝呋索爾代謝物進(jìn)行同時(shí)定性和定量分析，該方法簡(jiǎn)便、快速，可以滿足目前對(duì)動(dòng)物源食品中硝呋索爾代謝物殘留量的同時(shí)定性定量的檢測(cè)需求。

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