巖茶水庫嶺肉桂中原花青素的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法分析

侯冬巖，刁全平，吳 寒，李鐵純，回瑞華，王順明

（1.鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114007；2.武夷山市琪明茶葉科學(xué)研究所，福建 武夷山 354300）

原花青素廣泛的存在于各種植物中，如葡萄、山楂、銀杏、藍(lán)莓等，近年來，該類化合物所體現(xiàn)的生物活性屢見報道，其清除自由基等作用引起了人們極大的關(guān)注［1－4］。我國原花青素的自然資源豐富，但是研究多處于植化研究階段，有效成分的分離鑒定研究報道較少，開發(fā)的產(chǎn)品不多，其中研究最為廣泛的為葡萄。原花青素是多酚化合物的聚合體，單體一般包括兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯及它們3個自身或相互形成的二聚體。按聚合度的大小，通常將2～4聚體稱為低聚體（簡稱OPC），將5聚體以上的稱為高聚體（簡稱PPC），其中原花青素B2是自然界中最常見、研究的最多也是最重要二聚體［5－7］。4種原花青素類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于圖1。

圖1 4種原花青素類化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of 4kinds of procyanidins

由于原花青素同時存在多種的聚合度和聚合方式，使得自身組成十分復(fù)雜［8］。目前還沒有統(tǒng)一的質(zhì)量控制方法，常用的分析方法有紫外分光光度法［9］、高效液相色譜法和高效液相色譜－質(zhì)譜法［10－11］。但是這些分析方法測定茶葉中的原花青素都有較大的弊端，如紫外分光光度法只能測定原花青素的總成分，專屬性不強(qiáng)，不能區(qū)分多酚的種類；由于茶葉中基質(zhì)較為復(fù)雜，采用不能達(dá)到理想的原花青素分離，且保留時間長。

巖茶水庫嶺肉桂為烏龍茶，產(chǎn)于閩北“秀甲東南”的武夷山，茶樹生長在巖縫之中，茶湯具有綠茶之清香，紅茶之甘醇，是中國烏龍茶中之極品。有關(guān)巖茶水庫嶺肉桂的品質(zhì)、產(chǎn)地特征、生產(chǎn)、加工和營養(yǎng)成分，陳睿等［12］已有論述，但因其基質(zhì)復(fù)雜，且與原花青素結(jié)構(gòu)類似的多酚類物質(zhì)較多，所以其中原花青素的分析尚未見報道。本研究采用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，利用多重反應(yīng)監(jiān)測模式對巖茶水庫嶺肉桂樣品中的原花青素組分進(jìn)行定性和定量分析，為巖茶水庫嶺肉桂的進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑材料

1200型高效液相色譜儀、6410型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品；XYA2－40－H型帕恩特純水、超純水機(jī)：北京湘順源科技公司產(chǎn)品；BP211D型電子精密天平：德國賽多利天平有限公司產(chǎn)品；KQ－250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；ZXZ型旋片式真空泵：上海玉龍真空泵廠產(chǎn)品；TDZ5－WS型臺式自動平衡離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品。

兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，色譜級，CAS：154－23－4）、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，色譜級，CAS：490－46－0）、表兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，色譜級，CAS：1257－08－5）：天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司產(chǎn)品；原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，色譜級，CAS：1257－08－5）：成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品；甲酸、乙腈（色譜純）：北京化工廠產(chǎn)品；甲醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯（分析純）：北京化工廠產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

樣品：巖茶水庫嶺肉桂采于福建武夷山。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液 分別精確稱取5mg（精確到0.01mg）兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品，置于10mL容量瓶中，加乙腈稀釋、溶解、定容至刻度，得到濃度為500mg／L標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用0.22μm有機(jī)系微孔濾膜過濾，濾液置于－4℃避光保存，備用。

1.2.2 樣品前處理 精密稱取0.5g（精確到0.000 1mg）干燥粉碎的樣品，置于50mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入12.5mL 80%甲醇，于30℃下超聲40min提取，提取液經(jīng)抽濾過濾，除去提取時的殘渣，將濾液以5 000r／min離心10min，上清液經(jīng)濾紙過濾后用80%甲醇定容至50mL容量瓶中，再用0.22μm有機(jī)系微孔濾膜過濾，供高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析［13］。

1.2.3 色譜條件 色譜柱 Waters SunFire－C18柱（150mm×2.1mm×5μm）；流動相：A 為0.1% 甲 酸 水 溶 液，B 為 乙 腈；流 速 0.25 mL／min，柱溫25℃；進(jìn)樣量3μL；梯度洗脫程序列于表1［14－16］。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源（ESI），負(fù)離子掃描，多重反應(yīng)監(jiān)測，毛細(xì)管電壓－3 500 V，霧化氣壓力350kPa，干燥氣溫度350℃，干燥氣流量6L／min，碰撞能量30V。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.5 HPLC色譜分離 經(jīng)1.2.1配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和經(jīng)1.2.2處理的樣品進(jìn)行稀釋后，在1.2.3條件下液相色譜圖示于圖2。

比較原花青素標(biāo)準(zhǔn)樣品及樣品的HPLC色譜圖的保留時間，對巖茶水庫嶺肉桂樣品中的原花青素組分進(jìn)行初步分析。由圖可以看出，樣品中含有兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和原花青素B2。

圖2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品（b）的HPLC圖Fig.2 The HPLC of the proanthocyanidins standard（a）and the sample（b）

1.2.6 質(zhì)譜分析 由HPLC的分析結(jié)果，利用與標(biāo)準(zhǔn)品比對初步判定樣品中含有兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和原花青素B2，在質(zhì)譜分析中，采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式對上述的初步判定進(jìn)行確認(rèn)。4種原花青素的質(zhì)譜譜圖示于圖3。

從圖3（a）～3（c）可見，原花青素單體的質(zhì)譜圖主要產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子，碎片離子相對較少。圖3（d）除產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子外，還產(chǎn)生了一系列碎片離子。在碰撞能量為30V時，分別對兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和原花青素B2進(jìn)行子離子掃描，其質(zhì)譜圖示于圖4。

圖3 兒茶素（a）、表兒茶素（b）、表兒茶素沒食子酸酯（c）和原花青素B2（d）的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of catechin（a），epicatechin（b），epicatechin－3－O－gallate（c）and proanthocyanidin B2（d）

圖4 兒茶素（a）、表兒茶素（b）、表兒茶素沒食子酸酯（c）和原花青素B2（d）的離子質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of production of catechin（a），epicatechin（b），epicatechin－3－O－gallate（c）and proanthocyanidin B2（d）

通過一級質(zhì)譜選擇一定質(zhì)量母離子，與氣體碰撞斷裂后，再經(jīng)二級質(zhì)譜選擇一定質(zhì)量的子離子，這樣大大提高了分析的選擇性，同時也改善了信噪比，特別適合于復(fù)雜組分體系且干擾嚴(yán)重的樣品中低含量組分的分析。由圖3、圖4可確定兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和原花青素B2的定性和定量離子對，列于表2。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 從1.2.1配制的4種原花青素的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液中精確移取0.10、0.20、0.40、1.0、2.0、3.0mL 于10mL 和50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣前分別通過0.22μm有機(jī)系微孔濾膜過濾，在1.2.3條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。以原花青素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程列于表3。線性范圍為：兒茶素1.00～10.0mg／L；表兒茶素10.0～100mg／L；表兒茶素沒食子酸酯50.0～150mg／L；原花青素B25.00～30.0mg／L。

表2 4種原花青素的定性及定量離子對Table 2 The ion－pair of quantitative and qualitative of four oligomeric proanthocyanidins

表3 原花青素的回歸方程Table 3 Regression equation of the procyanidins

2 結(jié)果與討論

2.1 精密度實(shí)驗(yàn)

從1.2.1的4種原花青素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液中精確量取0.20mL制成10.00mg／L溶液，通過0.22μm有機(jī)系微孔濾膜過濾，在1.2.3條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。相同條件下測定7次，求得其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表4。

2.2 回收率實(shí)驗(yàn)

取1.2.2相同濃度的樣品，分別加入3個不同濃度的兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和原花青素B2的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.2.3條件下分別進(jìn)樣，記錄峰面積。計算該方法下測定4種原花青素的方法回收率，結(jié)果列于表5。

2.3 方法檢出限

取1.2.1的4種原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)稀釋并通過0.22μm有機(jī)系微孔濾膜過濾，在1.2.3條件下進(jìn)樣，當(dāng)響應(yīng)值為基線噪音的2倍時，測其峰面積。計算此時該標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度即為最低檢出限。兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、原花青素B2的檢出限分別為0.013 2、0.012 4、0.008 5、0.005 5mg／L。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)Table 4 Precision experiment

表5 方法的回收率Table 5 Recovery of the method

2.4 樣品測定

按照1.2.2的方法處理3批武夷山巖茶水庫嶺肉桂樣品，在1.2.3條件下每批分別進(jìn)樣3次，記錄峰面積并代入回歸方程，得到的武夷山巖茶水庫嶺肉桂原花青素的含量列于表6。

表6 樣品的測定Table 6 Determination of samples（n＝3，ˉx±s）

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，利用多重反應(yīng)監(jiān)測模式對巖茶水庫嶺肉桂樣品中的原花青素組分進(jìn)行定性和定量分析，可以有效的消除茶葉中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，并對茶葉中的原花青素可進(jìn)行逐一的定性及定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，武夷巖茶水庫嶺肉桂中含有豐富的原花青素類化合物兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和原花青素B2。

［1］ 呂麗爽.天然抗氧化劑低聚原花青素的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2002，23（2）：147－149.

［2］ SOUQUET J M，CHEYNIER V I，BROSSAUD F，et al.Polymeric proanthocyan－idins from grape seeds［J］.Phytochemistry，1996，43：509－512.

［3］ TORRES J L，VARELA B，GARCIA M T，et al.Valorization of grape （vitis viniferal ）by products.Antioxidant and biological properties of polyphenolic fractions differing in procyanidin composition and flavonol content［J］.J Agric Food Chem，2002，50（26）：7 548－7 555.

［4］ BUELGA S，SCALBERT C A.Review：Proanth－ocyanidins and tannin－like compounds nature，occurrence，dietary intake and effects on nutrition and health［J］.J Sci Food Agric，2000，80（7）：1 094－1 117.

［5］ 凌志群.蓮房原花青素及其生物、藥理活性成分［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

［6］ SMITH B E.Astringent tannins of the leaves ofGeraniumspecies［J］.Phytochemistry，1981，20（3）：211－216.

［7］ 姚育翠.玫瑰花中原花青素的分離分析及抗氧化活性的研究［D］.浙江：浙江大學(xué)，2008.

［8］ 暴悅梅，佟永薇，章勤學(xué).葡萄籽中原花青素的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31（1）：185－186.

［9］ 楊曉輝，汪 嶺.紫外分光光度法分析測定“黑美人”土豆原花青素［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（25）：13 643－13 644.

［10］ 刁海鵬，孫體健，姬小蕾，等.高效液相法測定爬山虎紅色素中原花青素含量［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25（5）：566－567.

［11］ LAZARUS S A，ADAMSON G E，HAMMERSTONE J F，et al.High performance liquid chromatography－mass spectrometry analysis of proant hocyanidins in foods and beverages ［J］.J Agric Food Chem，1999，4（1）：3 693－3 701.

［12］ 陳 睿.茶葉功能性成分的化學(xué)組成及應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，32：1 031－1 033.

［13］ 侯冬巖，回瑞華，李鐵純.高效液相色譜法對綠茶中茶多酚含量的測定［J］.食品科學(xué)，2010，31（24）：305－307.

［14］ 何忠梅，孫佳明，張 輝，等.固相萃?。咝б合嗌V－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法分析芍藥和酒芍藥的水溶性化學(xué)成分［J］.分析化學(xué)，2009，37（8）：1 201－1 205.

［15］ 廖 杰，宋玉喬，趙玉蘭，等.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物油中的6種兒茶素［J］.現(xiàn)代儀器，2008，14：35－37.

［16］ 任其龍，魏冠紅，金米聰，等.反相高效液相色譜－電噴霧質(zhì)譜法鑒定葡萄籽低聚原花青素［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（3）：79－85.