LC－MS／MS法研究厚樸酚與和厚樸酚在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為

馬莎莎，邵玉鳳，吳祥猛，王文艷，，劉萬卉

（1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東 煙臺 264005；2.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺 264005）

半夏厚樸湯出自張仲景的《金匱要略》，是由半夏、厚樸、生姜、紫蘇、茯苓5味藥材組成的經(jīng)典方劑，是仲景方中治療情志病的代表方劑。近年來其抗抑郁作用得到了學(xué)者們的關(guān)注［1－5］，藥理研究顯示厚樸酚與和厚樸酚作用廣泛［6－7］，被初步確定為半夏厚樸湯的主要抗抑郁成分［8－9］，其結(jié)構(gòu)式示于圖1，二者均為苯丙素的二聚體。目前，關(guān)于厚樸酚與和厚樸酚的測定方法有：熒光分光光度法［10］，該方法操作簡單、快速，但是準(zhǔn)確度較低；液相色譜法，常與紫外檢測器（HPLC－UV）聯(lián)用，是檢測厚樸酚與和厚樸酚最常用的方法，該方法適用范圍較廣，能夠在紫外全掃描圖譜中分辨色譜峰的純度，但是受檢測波長的限制，基線不平穩(wěn)，對定量有干擾［11］；另外還有與質(zhì)譜檢測器［12］、電化學(xué)檢測器［13］聯(lián)用等方法。

針對半夏厚樸湯的藥物配伍，前人已做了大量研究。徐群等［8］研究了方中君臣佐使分別對于厚樸酚與和厚樸酚溶出的作用；易立濤等［14］研究發(fā)現(xiàn)生姜與厚樸配伍后，對于神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)產(chǎn)生了協(xié)同作用；且生姜中6－姜醇能夠縮短厚樸酚與和厚樸酚在胃內(nèi)的滯留時間，減少后者從胃腸道中的直接排泄［15］；許臘英等［16］研究發(fā)現(xiàn)厚樸經(jīng)姜炙后其厚樸酚、和厚樸酚的含量都明顯增加：和厚樸酚增加約40%，厚樸酚增加約140%。本工作從體內(nèi)藥動學(xué)角度出發(fā)，采用LC－MS／MS法研究復(fù)方中厚樸酚與和厚樸酚的體內(nèi)行為，并通過與單味厚樸水煎液中兩個目標(biāo)化合物在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)行為的對比，進一步研究復(fù)方中其他藥物對于厚樸酚與和厚樸酚藥動學(xué)行為的影響。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

TSQ Quantum三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Thermo公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子化源（ESI）及 Xcalibur1.4控制軟件；Agilent 1100液相色譜系統(tǒng)：美國Agilent公司產(chǎn)品，包括四元輸液泵、自動進樣器、在線脫氣機。

圖1 厚樸酚與和厚樸酚的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of magnolol and honokiol

1.2 主要材料與試劑

半夏、厚樸、茯苓、生姜及紫蘇：購自山東醫(yī)藥公司，由煙臺大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定，結(jié)果如下：半夏為天南星科植物半夏pinelliaternate（Thunb.）Breit.的干燥塊莖；厚樸為木蘭科植 物 厚 樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils的干燥根皮；茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Schw.）Wolf的干燥菌核；生姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖；紫蘇為唇形科植物紫蘇Perillafrytescens（L.）Britt.的干燥葉。厚樸酚與和厚樸酚對照品（純度＞98%，批號 MUST－11050602）：成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品；內(nèi)標(biāo)萘普生（純度＞98%）：購自中檢所；乙腈、甲醇（色譜純）：德國Merck公司產(chǎn)品。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters XTerra C18柱（100mm×2.1mm×3.5μm）；流動相：V（乙腈）∶V（0.1mmol／L乙酸銨）＝75∶25的溶液；流速0.2mL／min；柱溫30 ℃；進樣量5μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜檢測采用電噴霧離子化電離源（ESI），源電壓3 000V；離子傳輸毛細管溫度350℃；鞘氣和輔助氣均為氮氣，壓力分別為2.06×105、3.45×104Pa，厚樸酚、和厚樸酚和萘普生的碰撞能量分別為30、28、20eV；負(fù)離子方式檢測；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM），厚樸酚、和厚樸酚和內(nèi)標(biāo)定量分析的離子對分別為m／z265→247，m／z265→224 及m／z229→170。

1.4 溶液配制及樣品處理

1.4.1 供試品溶液的配制 稱取2倍處方量的藥材，加入8倍體積的水，浸泡40min，煎煮1h，過濾，殘渣加入6倍量的水再煎煮1h，合并兩次濾液；50℃減壓濃縮，流浸膏用淀粉吸收后制成顆粒，晾干，研磨成細粉。使用時加熱水制成40 mL混懸液。稱取2倍處方量的厚樸藥材，同法進行處理。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取厚樸酚、和厚樸酚適量，溶于一定量甲醇中配成濃度為1g／L的儲備液，置于4℃冰箱中備用。取適當(dāng)體積的厚樸酚與和厚樸酚的儲備液，用甲醇依次稀釋 成 濃 度 為：10、20、50、200、500、2 000、5 000、10 000μg／L的工作液，待用。精密稱取內(nèi)標(biāo)（萘普生）適量，溶于甲醇中配成儲備液，置于4℃冰箱中備用。使用時稀釋成濃度為500 μg／L的內(nèi)標(biāo)工作液，待用。

1.4.3 動物實驗 雄性SD大鼠（體重230～260g，山東綠葉制藥有限公司動物房提供）12只，隨機分為兩組，實驗前12h禁食。灌胃給予半夏厚樸湯復(fù)方及單獨厚樸藥材水煎液（半夏厚樸湯復(fù)方水煎液中和厚樸酚與厚樸酚的濃度分別為1.02、2.55g／L；厚樸水煎液中和厚樸酚與厚樸酚的濃度分別為1.15、2.87g／L），給藥劑量厚樸酚約為20mg／kg，和厚樸酚約為8mg／kg。分別于給藥前及給藥后5min、15min、30 min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h眼內(nèi)眥取血，每一時間點采血量約為0.3mL，實驗過程中大鼠自由飲水。

1.4.4 血漿樣品的處理 精密取100μL血漿，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液（500μg／L萘普生），50μL 0.05mol／L HCl，渦旋混勻，加入3mL提取液（V（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（異丙醇）＝2∶1∶0.1），渦旋3min，離心10min（3 600 r／min），取上清液，35℃空氣吹干，100μL流動相復(fù)溶殘渣，渦旋混合，離心10min（13 000 r／min），取上清液，按照上述色譜及質(zhì)譜條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理過程 目前生物樣品中厚樸酚與和厚樸酚的提取方法有：蛋白沉淀法、液－液萃取法、固相萃取（SPE）法和液相微萃?。撬筝腿》ǎ↙PME－NBE）［17］。本實驗樣品處理采用了經(jīng)典的液－液萃取法，分別考察了V（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（異丙醇）＝2∶1∶0.1溶液及乙酸乙酯的提取效率，前者處理后能較大程度地提高目標(biāo)化合物的回收率（均在80%以上），故實驗中加入3mLV（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（異丙醇）＝2∶1∶0.1溶液，渦旋3 min作為提取方法。另外考慮到目標(biāo)化合物為弱酸性［18］，為提高其回收率，減少損失，分別考察了處理過程中加入不同濃度的 HCl（0.1、0.05、0.01mol／L）對回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入50μL 0.05mol／L HCl時，厚樸酚與和厚樸酚的回收率較另外兩者要高。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)化合物的篩選 分別考察了白藜蘆醇及萘普生作為內(nèi)標(biāo)的情況。兩者的液相行為很相似（在上述液相條件下出峰時間都在1.3 min附近）；從回收率來看，V（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（異丙醇）＝2∶1∶0.1條件下白藜蘆醇回收率較萘普生要低，最終選擇萘普生為內(nèi)標(biāo)。

2.1.3 質(zhì)譜條件 厚樸酚與和厚樸酚互為同分異構(gòu)體，正離子模式下信號很弱，負(fù)離子模式下分子離子峰相同，不能分別進行定量，但二者的二級質(zhì)譜碎片不同，示于圖2。厚樸酚結(jié)構(gòu)中兩個羥基距離較近，能夠脫去一分子水，形成穩(wěn)定的環(huán)結(jié)構(gòu)，相應(yīng)碎片m／z247，為厚樸酚的特征二級碎片離子；和厚樸酚二級斷裂中則丟掉烯丙基碎片，得到m／z224的特征碎片［19］。在相應(yīng)的質(zhì)譜條件下，兩者定量離子對互不干擾，信號強且穩(wěn)定。故通過監(jiān)測m／z265→247及m／z265→224兩離子對，可同時測定厚樸酚與和厚樸酚這對同分異構(gòu)體。

2.2 方法學(xué)確證

2.2.1 專屬性 分別取空白血漿、空白血漿加入標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本及實際生物樣本，按上述血漿樣本處理方法及檢測條件進行定量分析，其色譜圖示于圖3。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾厚樸酚、和厚樸酚及內(nèi)標(biāo)萘普生的測定，方法專屬性良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察 分別取10μL儲備液，加入10μL內(nèi)標(biāo)（相當(dāng)于血漿藥物濃度為50 μg／L），100μL空白鼠血，其余操作按1.4.4進行，取上清液進行LC－MS／MS分析。以血漿中藥物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比為橫坐標(biāo)，以兩者峰面積之比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W＝1／χ2）最小二乘法進行回歸運算，求得回歸方程，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。厚樸酚的回歸方程為y＝0.018 56x＋0.048 00，r＝0.999 6；和 厚 樸 酚 的 回 歸 方 程 為y＝0.036 26x－0.000 641 9，r＝0.997 9。二者的線性范圍為1～ 1 000μg／L，定量下限為1 μg／L。

2.2.3 準(zhǔn)確度與精密度 按照1.4.2項制備低、中、高3個濃度（相當(dāng)于血漿藥物濃度為2、40、800μg／L）的質(zhì)控樣品（QC），每濃度5樣本，連續(xù)測定3天，根據(jù)當(dāng)日的工作曲線，計算QC樣品的測得濃度，根據(jù)QC樣品結(jié)果計算該方法的準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果列于表1。結(jié)果顯示，日間、日內(nèi)變異均小于15%，厚樸酚與和厚樸酚的相對偏差分別為3.4%～6.6%、0.5%～4%，精密度和準(zhǔn)確度均較高，重現(xiàn)性較好。

2.2.4 提取回收率 取100μL血漿，按照1.4.2項制備低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品（相當(dāng)于血漿藥物濃度2、40、800μg／L），分別按照1.4.4處理后，取上清液進樣，進行LC－MS／MS分析，每一濃度平行3樣本分析。另取100μL空白血漿于10mL玻璃管內(nèi)，加入3mL提取液（V（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（異丙醇）＝2∶1∶0.1），具塞，渦旋3min混勻，離心10min（3 600r／min），取上清液，35 ℃空氣吹干，殘渣用流動相復(fù)溶，并加入適當(dāng)體積的工作液，制備成相應(yīng)濃度的質(zhì)控樣品，渦旋混合，離心10min（13 000r／min），取上清液進行 LC－MS／MS分析，每一濃度平行3樣本分析。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。

厚樸酚低、中、高3個濃度的回收率分別為：（102.3±10.6）%、（94.9±2.0）%、（97.5±6.6）%；和厚樸酚低、中、高3個濃度的回收率分別為：（98.8±6.2）%、（102.4±7.4）%、（93.0±4.2）%；內(nèi)標(biāo)的提取回收率為（84.4±5.1）%。

圖2 厚樸酚（a）與和厚樸酚（b）的［M－H］－二級全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Full－scan product ion spectra of［M－H］－ for magnolol（a）and honokiol（b）

圖3 LC－MS／MS測定大鼠血漿和厚樸酚及厚樸酚的典型色譜圖Fig.3 Chromatograms of magnolol and honokiol in rat plasma

2.2.5 定量下限（LLOQ） 分別取10μL厚樸酚與和厚樸酚工作液（濃度均為10μg／L），加入10μL內(nèi)標(biāo)（濃度為500μg／L），100μL空白鼠血（相當(dāng)于含藥濃度為1μg／L），其余操作按1.4.4進行，取上清液進行 LC－MS／MS分析。每種化合物5樣本平行分析，連續(xù)測定3天，根據(jù)當(dāng)日的工作曲線，計算樣品的測得濃度，計算該方法的準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果列于表1。結(jié)果顯示，LLOQ的日間、日內(nèi)變異均小于15%。厚樸酚與和厚樸酚的相對偏差分別為0.6%、0.3%，精密度和準(zhǔn)確度均較高，重現(xiàn)性較好。

2.3 方法學(xué)應(yīng)用

利用所建立的方法研究大鼠血漿中厚樸酚與和厚樸酚的藥動學(xué)行為，藥時曲線示于圖4，主要藥動學(xué)參數(shù)列于表2。從藥動學(xué)參數(shù)來看，給藥后目標(biāo)化合物在復(fù)方及單方中的藥動學(xué)行為有差別：復(fù)方的生物利用度較單方要高，消除速率較快，表觀分布容積較小。對比兩化合物而言，厚樸酚在體內(nèi)的生物利用度較和厚樸酚高，消除較快。綜上可知，復(fù)方中其他藥物影響了厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的體內(nèi)藥動學(xué)行為。

表1 LC－MS／MS法測定血漿中厚樸酚與和厚樸酚的準(zhǔn)確度與精密度（n＝15）Table 1 The precision and accuracy of magonol and honokiol in rat plasms by LC－MS／MS

圖4 灌胃復(fù)方及單方后和厚樸酚（a）與厚樸酚（b）在SD大鼠體內(nèi)的藥時曲線Fig.4 Plasma concentration versus time curves of honokiol（a）and magnolol（b）of Banxia－Houpu decoction and magnolia officinalis

表2 大鼠灌胃給予半夏厚樸湯及單味厚樸水煎液后和厚樸酚與厚樸酚的主要藥動學(xué)參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of honokiol and magnolol in rats after intragastric administration of Banxia－Houpu decoction and magnolia officinalis

3 結(jié)論

厚樸是方中臣藥，能行氣化濕、暢中除滿，藥理研究表明，厚樸有抗菌抗炎、清除自由基、抗細胞凋亡等作用，其中厚樸酚、和厚樸酚具有抗氧化、神經(jīng)保護及營養(yǎng)等活性，被初步確定為全方抗抑郁活性主要成分，抗抑郁機制可能與其抗氧化［20］、增強機體免疫能力、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的水平等有關(guān)［21］。

有關(guān)厚樸酚與和厚樸酚在生物體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究已有報道，但大多都是研究厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的藥動學(xué)變化［22－24］，而厚樸復(fù)方中兩者的藥代動力學(xué)研究較少；而且檢測手段以 HPLC－UV為主，分析時間較長。本工作建立的LC－MS／MS分析方法靈敏，大大縮短了分析時間，干擾小，適用于生物樣品中厚樸酚與和厚樸酚的研究。從藥動學(xué)數(shù)據(jù)來看，兩個目標(biāo)化合物的生物利用度復(fù)方與單方存在差別，故推斷復(fù)方中其他藥味配伍后影響了厚樸酚與和厚樸酚的體內(nèi)過程，仍需進一步研究和探討。本研究下一步工作計劃是從其他多個方面進一步考察配伍的藥動學(xué)意義。

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