微波輔助萃?。瓪庀嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定皮革制品中20種鄰苯二甲酸酯含量

王成云，徐 嶸，吳透明，彭圳圳，褚乃清

（深圳出入境檢驗檢疫局，廣東 深圳 518045）

我國現(xiàn)已成為世界皮革的加工中心和貿(mào)易中心，而歐盟是我國最重要的皮革出口市場，據(jù)統(tǒng)計，我國出口的皮革制品中，80%以上出口歐盟［1］。在皮革生產(chǎn)中需要使用大量的加工助劑，其中部分加工助劑對人體健康和環(huán)境安全有害。近年來多次在皮革制品中檢出鄰苯二甲酸酯（PAEs），其具有雌性激素效應(yīng)，甚至能致癌［2－5］。為保護消費者身體健康，維護環(huán)境安全，世界各國紛紛立法限制使用鄰苯二甲酸酯，且受限制的鄰苯二甲酸酯種類不斷增加［6－8］。歐洲化學品管理署現(xiàn)已將鄰苯二甲酸二（乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）列為需授權(quán)物質(zhì)，并將鄰苯二甲酸二（2－甲氧基乙基）酯（DMOEP）列入第六批高關(guān)注物質(zhì)清單［9－10］。出口歐盟的商品必須滿足歐盟委員會關(guān)于化學品注冊、評估、授權(quán)和限制（REACH）法規(guī)對高關(guān)注物質(zhì)的有關(guān)規(guī)定，否則將被召回，甚至被趕出歐盟市場［11］。近年來，已發(fā)生多起我國出口歐盟的鞋類產(chǎn)品因檢出鄰苯二甲酸酯而被召回的事件［12］，對我國皮革制品的出口造成不利的影響。加強對皮革制品中鄰苯二甲酸酯的監(jiān)管，是保障我國皮革制品順利出口歐盟的重要手段。但目前只有對鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP）、DEHP、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、DBP、鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）和BBP的檢測標準［13］，雖有文獻報道了皮革制品中DIBP的測定方法［14］，但并未全部覆蓋所有已被列入高關(guān)注物質(zhì)的鄰苯二甲酸酯。因此，有必要建立能同時測定包含所有列入高關(guān)注物質(zhì)清單的鄰苯二甲酸酯在內(nèi)的多種鄰苯二甲酸酯的測定方法。微波輔助萃取技術(shù)具有簡便快速、檢測通量大、使用化學試劑少等優(yōu)點［15－18］，而串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度高、受基體干擾少［19－21］。本研究采用微波輔助萃取技術(shù)提取皮革制品中的鄰苯二甲酸酯，提取物經(jīng)固相萃取柱凈化后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，從而建立一種同時測定皮革制品中20種鄰苯二甲酸酯的方法，并用于市售皮革制品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MARS 5型微波萃取儀：美國CEM公司產(chǎn)品；Retch SM 2000織物研磨儀：德國 Retch公司產(chǎn)品；Agilent 7890A－7000B三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；Heidolph 4003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司產(chǎn)品；氮吹儀：北京康林科技有限責任公司產(chǎn)品；0.45μm濾膜：德國Membrana公司產(chǎn)品；固相萃取柱（中性氧化鋁，500mg／3mL）：美國Agilent公司產(chǎn)品。

鄰苯二甲酸二（2－乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二（2－乙氧基乙基）酯（DEOEP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP）、鄰 苯 二 甲 酸二 （2－丁氧 基 乙 基）酯（DBOEP）、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（DAP）、鄰苯二甲酸二烯丙酯（DALP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、鄰苯二甲酸二（2－甲氧基乙基）酯（DMOEP）、鄰苯二甲酸二己酯（DHXP）、鄰苯二甲酸二丙酯（DPRP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）、鄰苯二甲酸二庚酯（DHP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、鄰苯二甲酸二（4－甲基－2－戊基）酯（DMPP）、鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）：均由百靈威公司提供，其純度均大于99.0%；乙腈、甲醇、環(huán)己烷、二氯甲烷、異丙醇、石油醚、三氯甲烷、丙酮、正己烷、叔丁基甲醚、乙醇、乙酸乙酯（分析純）：廣州化學試劑廠產(chǎn)品；甲醇（色譜純）：TEDIA公司產(chǎn)品。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取各標準品，用甲醇溶解，配制成適當濃度的標準溶液儲備液。分別移取適量的各標準溶液儲備液，配制成合適濃度的混合標準溶液儲備液，用甲醇逐級稀釋至所需濃度。

1.3 樣品前處理

樣品用織物研磨儀磨成粉末，稱取1.0g樣品，置于微波萃取管中，加入15mL萃取溶劑進行微波萃取，萃取溫度比溶劑的沸點高約20℃。萃取完成后，冷卻至室溫，收集上清液，用15mL萃取溶劑進行第二次萃取，過濾，合并濾液；濾液

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，在室溫下用氮氣緩慢吹干。用10mL甲醇溶解殘留物，轉(zhuǎn)移至已用5mL甲醇活化的固相萃取柱中進行凈化；用10mL甲醇分多次淋洗，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后，用氮氣緩慢吹干；再用2mL甲醇溶解殘渣，定容至25mL；溶液用0.45μm濾膜過濾，進行 GCMS／MS分析。必要時可適當?shù)南♂尅?/p>

1.4 分析條件

1.4.1 氣相色譜條件 Agilent HP－5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升溫：初始溫度90℃，保持1min，以15℃／min升至210℃，保持2min，以5℃／min升至240℃，保持5min，以5℃／min升至250℃，保持5min，以25℃／min升至300℃，保持4min；傳輸線溫度：280℃；進樣口溫度：260℃；進樣量：1μL；不分流進樣；載氣：氦氣（純度＞99.999%），流速1.2mL／min；溶劑延遲5.0min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電子轟擊離子化（EI）；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離能量：70eV；氮氣流量：1.5mL／min；氦氣流量：2.25mL／min；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式測定，其條件列于表1。

表1 目標物的多反應(yīng)監(jiān)測條件Table 1 MRM conditions of targets

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的選擇

影響微波萃取效率的主要因素是萃取時間、萃取溶劑種類、萃取壓力和萃取溫度。較大的萃取壓力、較高的萃取溫度、較長的萃取時間均有利于提高萃取效率［15］。

通過改變微波萃取時間，觀察萃取量的變化。開始時，萃取量隨萃取時間的增長而增加，但萃取時間大于15min時，萃取量的變化就很小。在本實驗中，為充分保證萃取效果，選擇萃取時間為30min。

萃取壓力取決于萃取溶劑的體積和萃取溫度。通常情況下，萃取溶劑體積約占萃取管體積的三分之一。萃取溫度較高時，萃取管內(nèi)壓力也隨之升高，萃取溶劑的沸點也相應(yīng)上升。萃取管材料為聚四氟乙烯，可耐260℃的高溫，耐壓高達50個大氣壓。微波萃取溫度通常設(shè)定為比萃取溶劑的沸點高10～20℃。在本實驗中，微波萃取溫度設(shè)定為比沸點高約20℃。對于每種萃取溶劑，其萃取溫度是確定的，因此萃取管內(nèi)壓力也隨之確定。

影響萃取效率最關(guān)鍵的因素是萃取溶劑種類。目標分析物在溶劑中的溶解度、溶劑與基體之間的相互作用、溶劑的微波吸收特性等均對萃取效率有影響。本研究選取異丙醇、乙腈、V（三氯甲烷）∶V（甲醇）＝2∶1的溶液、叔丁基甲醚等17種溶劑作為微波萃取溶劑，對一種市售皮革制品中的鄰苯二甲酸酯進行微波萃取，考察其萃取效果，結(jié)果列于表2。數(shù)據(jù)表明，對于不同的鄰苯二甲酸酯，其最佳萃取溶劑各不相同，而乙腈對于每種鄰苯二甲酸酯的萃取效果均較好。綜合考慮，選擇乙腈為萃取溶劑。

2.2 凈化條件的確定

皮革基質(zhì)相當復(fù)雜，萃取液中含有較多雜質(zhì)，為保護色譜柱，需對其進行凈化處理。通?？捎霉滔噍腿≈M行凈化處理，選擇HLB柱、Sep－Pak柱、中性氧化鋁柱、LC－C18柱、硅藻土柱等5種常用固相萃取柱凈化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用中性氧化鋁柱凈化時，色譜圖中雜質(zhì)峰最少。用混標溶液分別過柱，測定各固相萃取柱的回收率，結(jié)果表明，中性氧化鋁柱的回收率遠高于其他萃取柱。因此，選擇中性氧化鋁固相萃取柱進行凈化。過柱后，用3mL甲醇多次淋洗固相柱，分別收集每次的洗脫液，經(jīng)測定，前3次洗脫液中均可檢出鄰苯二甲酸酯，而第4次洗脫液中則未檢出。為盡量收集目標化合物，同時盡可能去除基質(zhì)干擾，本研究用10mL甲醇分多次淋洗固相萃取柱。

表2 不同溶劑的萃取效果（mg／kg）Table 2 The extraction effects of various solvents

2.3 分析條件的確定

改變氣相色譜分離條件，觀察各組分的分離情況，選擇分離效果最佳時的條件為最終氣相色譜分離條件。在此條件下對混標進行單級質(zhì)譜全掃描分析，確定各組分的保留時間，找出各組分的一級碎片離子。對每個組分選擇強度較高的碎片離子作為母離子，在離子轟擊掃描模式下進行電離轟擊，碰撞能量分別為40、35、30、25、20、15、10、5V，觀察產(chǎn)生的二級子離子強度隨碰撞能量的變化，二級子離子響應(yīng)最大的碰撞能量就是最終優(yōu)化的碰撞能量。選擇豐度最高的一對子離子對進行定性定量分析，其中豐度最高的子離子對用于定量分析。在表1列出的條件下，對混標進行分析，得到的MRM總離子流圖示于圖1。DIDP和DINP均為五指峰，DNP位于DIDP五指峰中間，其余17種鄰苯二甲酸酯的分離完全，譜峰峰形尖銳，對稱性好。

2.4 線性關(guān)系和定量下限

在空白基質(zhì)中添加不同濃度的混標溶液，按上述條件進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于每個組分，其質(zhì)量濃度C在一定范圍內(nèi)與響應(yīng)值A(chǔ)之間有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.996，各組分的線性方程、線性范圍及線性相關(guān)系數(shù)列于表3。在S／N＝10的條件下，確定各組分的定量下限。

2.5 方法的精密度和回收率

對一個市售皮革制品中的鄰苯二甲酸酯進行測定，共測定9份平行樣，計算方法的精密度，結(jié)果列于表4，方法的精密度令人滿意。

采用在空白樣品中添加混標溶液的方法測定方法的回收率，選用不含目標分析物的皮革制品為空白樣品，分別添加低、中、高3個濃度水平的混標溶液，每個濃度水平測試9個平行樣，計算各組分的平均回收率，結(jié)果表明，方法的平均回收率為87.75%～94.59%。

圖1 混標的多反應(yīng)監(jiān)測總離子流圖Fig.1 MRM total ion chromatography of mixed standards

表3 方法的線性關(guān)系和定量下限Table 3 The linear relation and limits of quantification

表4 方法的精密度Table 4 The precision experiment

2.6 實際樣品測試

采用本工作建立的方法對47個皮革制品（29個皮鞋樣品、18個皮革樣品）進行測試，結(jié)果在2個樣品中檢出多種鄰苯二甲酸酯，其余45個樣品則未檢出。2個陽性樣品分別為暗紅色和墨綠色皮革制品，均檢出DINP、DIBP、DEHP和DBP，暗紅色皮革制品的含量分別為670.9、17.9、9.6、2.9mg／kg，墨綠色皮革制品的含量分別為632.4、52.3、5.5、4.7mg／kg。暗紅色皮革制品萃取液的MRM總離子流圖示于圖2。

圖2 一個實際樣品的MRM總離子流圖Fig.2 MRM total ion chromatography of a real sample

3 結(jié)論

以乙腈為萃取溶劑，采用微波輔助萃取技術(shù)提取皮革制品中的鄰苯二甲酸酯，提取液經(jīng)固相萃取柱凈化后進行氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析，從而建立一個同時測定皮革制品中20種鄰苯二甲酸酯的氣質(zhì)聯(lián)用方法。該方法簡捷快速、靈敏度高、定量下限低，可以檢測對象涵蓋了REACH法規(guī)中被列入高關(guān)注物質(zhì)清單的所有鄰苯二甲酸酯，能滿足皮革制品中鄰苯二甲酸酯檢測的需求。

［1］ 田 美.中國皮革工業(yè)現(xiàn)狀分析及發(fā)展對策［J］.中國皮革，2008，37（1）：42－44.

［2］ 王小逸，林興桃，客慧明.鄰苯二甲酸酯類環(huán)境污染物健康研究新進展［J］.環(huán)境與健康，2007，24（10）：820－821.

［3］ 魏愛雪，徐曉白.環(huán)境中鄰苯酸酯類化合物污染研究概況［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2005，6（7）：89－93.

［4］ 陳 如，蔣曉琪，王建平.鄰苯二甲酸酯及其生態(tài)毒性［J］.印染助劑，2010，27（9）：52－56.

［5］ 董夫銀，閆 杰.歐盟及美國禁用鄰苯二甲酸的法規(guī)及其出臺始末［J］.檢驗檢疫科學，2006，16（3）：78－80.

［6］ Directive 2005／84／EC of the European Parliament and of the Council of 14December 2005Amending for the 22nd time Council Directve 76／769／EEC on the approximation of the laws，regulations and administrative provisions of the Member States relating to restrictions on the marketing and use of certain dangerous substances and preparations（phthalates in toys and childcare articles）［S］.Official Journal of the European Union，2005，L344：40－43.

［7］ Statement of Policy：Testing of component parts with respect to section 108of the consumer product safety improvement act［S］.CPSC，2008.

［8］ Australian Competition ＆ Consumer Commission.Product Safety Bulletin－Children’s Plastics Products with more than 1percent diethyl hexyl phthalate（DEHP），2010.

［9］ Corrigendum to Commission Regulation（EU）No.143／2011of 17February 2011amending Annex XIV to Regulation （EC）No.1907／2006of the European Parliament and of the Council on the Registration，Evaluation，Authorisation and Restriction of Chemicals （REACH）［S］.Official Journal of the European Union，2011，L49：52－53.

［10］ Commission Regulation（EU）No.125／2012of 14February 2011amending Annex XIV to Regulation（EC）No.1907／2006of the European Parliament and of the Council on the Registration，Evaluation，Authorisation and Restriction of Chemicals（REACH）［S］.Official Journal of the European Union，2012，L41：1－4.

［11］ PUNTENER A G.皮革工業(yè)面臨的 REACH 條款與挑戰(zhàn)［J］.中國皮革，2010，39（1）：23－25.

［12］ 路 華.2011年歐盟非食品快速預(yù)警系統(tǒng)（RAPEX）對中國鞋類通報簡析［J］.皮革與化工，2012，29（1）：38－38.

［13］ 沈 兵，竺媚筠，趙立國，等.GB／T 22931—2008皮革和毛皮－化學試驗－增塑劑的測定［S］.北京：中國標準出版社，2009.

［14］ 李天寶，劉 煒，王春利，等.皮革制品中鄰苯二甲酸二異丁酯含量的檢測方法研究［J］.西部皮革，2010，32（23）：32－34.

［15］ CANO J M，MARIN M L，SANCHEZ A，et al.Determination of adipate plasticizers in poly（vinyl chloride）by microwave－assisted extraction［J］.J Chromatogr A，2002，963（2）：401－409.

［16］ 李 偉.塑料包裝材料鄰苯類化合物提取方法的比較［J］.包裝工程，2011（32），（7）：47－50.

［17］ 應(yīng)劍波，謝偉宏，程建波，等.微波萃取－GPC凈化－GC／MS法檢驗血中氨基甲酸酯和沙蠶毒素類農(nóng)藥［J］.質(zhì)譜學報，2009，30（1）：47－50.

［18］ 王成云，李麗霞，張偉亞，等.微波輔助萃?。瘹庀嗌V法測定抗菌紡織品中的三氯生［J］.應(yīng)用化學，2012，29（1）：118－122.

［19］ 王成云，李麗霞，謝堂堂，等.微波輔助萃取－氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定紡織品中6種有機磷阻燃劑［J］.色譜，2011，29（8）：731－736.

［20］ 王成云，謝堂堂，張偉亞，等.微波萃?。璆C／MS／MS測定抗菌織物的三氯生含量［J］.印染，2011，37（20）：32－35.

［21］ 王成云，張偉亞，謝堂堂，等.氣相色譜／串聯(lián)質(zhì)譜法測定塑料制品中的禁用芳香胺［J］.塑料科技，2011，39（6）：66－70.