液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牙膏中16種磺胺類藥物殘留

張 巖，馬曉斐，呂 品，龐 坤，李 揮，叢 斌

（1.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，河北 石家莊 050017；2.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北 石家莊 050091）

磺胺類藥物為常見抗菌劑，因其具有明顯的抗感染、高效、低毒等特點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛使用［1－2］。然而過量使用這些抗菌劑會導(dǎo)致藥物殘留，破壞人的造血系統(tǒng)，造成溶血性貧血癥，影響人類健康［3］。

牙膏是生活必需品，具有清潔口腔、抗感染、殺菌等功效［4－6］。我國化妝品衛(wèi)生規(guī)范已經(jīng)禁止在化妝品（包括口腔衛(wèi)生產(chǎn)品）中添加磺胺類藥物［7］。但某些生產(chǎn)企業(yè)為了片面追求口腔疾病的防治效果，向牙膏等口腔衛(wèi)生產(chǎn)品中違規(guī)添加磺胺類藥物，嚴(yán)重危害人們的身體健康。如果添加磺胺類藥物的牙膏在口內(nèi)停留的時間太長不被涮出，會發(fā)生藥物殘留，引起毒副反應(yīng)［8－10］。

目前，磺胺類藥物殘留的檢測方法有薄層色譜法，高效液相色譜法（HPLC）［11－14］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）［15－17］。近年來，有關(guān)單類或多類抗生素的檢測多集中于環(huán)境、食品、飼料、祛痘除螨類化妝品等樣本［18］，尚未見牙膏中磺胺類藥物的檢測報道。本實驗參考了文獻(xiàn)［19－20］的前處理方法，采用 LC－MS／MS法測定牙膏中磺胺類藥物殘留，為監(jiān)管部門規(guī)范管理口腔衛(wèi)生產(chǎn)品市場提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1200－6410超快速液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國 Agilent公司產(chǎn)品；CT15RT高速冷凍離心機(jī)：上海天美公司產(chǎn)品；AE200萬分之一分析天平：法國 Mettler公司產(chǎn)品；渦旋混勻器（SK－1）：江蘇中大儀器廠產(chǎn)品。

磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺－6－甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基異噁唑、磺胺嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲異噁唑、磺胺甲噻二唑和磺胺醋酰標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）：美國Sigma公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純）：美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；去離子水：由美國Millipore公司超純水器制得。

1.2 實驗步驟

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備 分別將16種磺胺用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 000mg／L儲備液，使用時用乙腈稀釋成所需的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4℃冰箱保存。

1.2.2 牙膏樣品前處理方法 稱取2.5g（準(zhǔn)確至0.001g）樣品于50mL比色管中，加入V（0.1% 甲酸水溶液）∶V（乙腈）＝90∶10的溶液，定容至25mL，于渦旋混勻器上漩渦2min，于25℃水浴超聲提取20min。準(zhǔn)確量取1.0mL該樣品提取溶液于100mL容量瓶中，加入V（0.1% 甲酸水溶液）∶V（乙腈）＝90∶10的溶液定容，振搖2min，靜置后取約5.0mL上清液于10mL 塑料離心管中，以15 000r／min離心5min，過0.2μm 濾膜，濾液供 HPLC－MS／MS測定。

1.3 實驗條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell 120SB－C18（3.0mm×100mm×2.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）－乙腈（B）；流速0.3mL／min；梯度洗脫：0min、12%B，0～20min、12%B，20～20.1min、12%B～50%B，20.1～25min、50%B～100%B，25～30min、100%B～100%B，30～30.1min、100%B～12%B，30.1～37min、12%B～12%B；柱溫35℃；進(jìn)樣量5μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI），正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，干燥氣（He）溫度350℃，干燥氣流速12L／min，離子源溫度120℃，毛細(xì)管電壓4 000V，檢測目標(biāo)物的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 磺胺類物質(zhì)檢測質(zhì)譜條件Table 1 MS／MS conditions for the detection of sulfonamide residues

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

實驗考察了不同提取溶劑（水、甲醇、乙腈、甲酸水溶液、甲醇－甲酸水溶液、乙腈－甲酸水溶液）和不同提取時間（10、15、20、25、30min）的提取回收率及提取效果。結(jié)果表明：當(dāng)采用V（0.1% 甲酸水溶液）∶V（乙腈）＝90∶10的溶液為提取溶劑時，萃取的目標(biāo)物對質(zhì)譜檢測幾乎沒有干擾，效果最好；當(dāng)超聲提取時間為20min時，各化合物的提取回收率趨于穩(wěn)定，均能獲得83.9%～112%的回收率。因此，實驗選擇V（0.1% 甲酸水溶液）∶V（乙腈）＝90∶10的溶液為提取溶劑，超聲提取20min。

2.2 色譜柱的選擇及分離條件的優(yōu)化

本研究對比了3種色譜柱（Agilent poroshell 120SB－C18、Agilent ZORBAX SB－C18和Agilent Eclipse Plus－C18）對16種磺胺類藥物的分離效果和峰形。結(jié)果表明，目標(biāo)物在Agilent poroshell 120SB－C18（3.0mm×100mm×2.7μm）色譜柱上得到了最為理想的分離效果和峰形。另外，實驗發(fā)現(xiàn)部分磺胺化合物在不同固相色譜柱上的洗脫順序發(fā)生了改變，表現(xiàn)出分離選擇性的差異。

本研究考察了甲醇－0.1%甲酸水、乙腈－0.1%甲酸水和10mmol甲酸胺－0.1%甲酸水混合溶劑體系作為流動相對磺胺類化合物的色譜行為和離子化程度的影響。研究表明，當(dāng)流動相為乙腈－0.1%甲酸水時，儀器響應(yīng)值高于其他流動相時的響應(yīng)值。除了考察流動相組成外，還比較了在乙腈－水流動相體系中分別加入0.01%、0.05% 、0.1%、0.25%和0.5%甲酸對目標(biāo)物響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，以甲醇—0.1%甲酸水溶液作為流動相獲得了最優(yōu)的色譜分離效果和質(zhì)譜信號響應(yīng)。這是由于磺胺類化合物具有弱堿性，當(dāng)流動相中加入一定的酸性物質(zhì)（如甲酸）時，會促進(jìn)磺胺的電離，并為陽離子的形成提供必需的質(zhì)子來源，從而提高其離子化效率。由于16種磺胺類化合物的極性差異較大，采用等度洗脫很難將多組分磺胺同時分離測定，而采用梯度洗脫則可以較好地解決這一問題。在梯度洗脫初始階段以低比例有機(jī)相作為流動相，將極性較強(qiáng)的組分先洗脫出來，然后逐漸增加有機(jī)相比例，使極性較弱的組分逐一流出色譜柱，從而實現(xiàn)16種磺胺類藥物的有效分離。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)磺胺類化合物具有仲氨基或叔氨基的化學(xué)電離性質(zhì)，選用ESI＋作為離子化模式，流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。在正離子檢測方式下對每種磺胺進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，得到分子離子峰，再對每種磺胺的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息，然后對得到的二級質(zhì)譜進(jìn)行裂解電壓、碰撞氣能量優(yōu)化，使每種磺胺的分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大時為最佳。選擇每種磺胺的監(jiān)測離子對，將液相色譜和串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用，再對離子源溫度、輔助氣流速進(jìn)行優(yōu)化，使樣液中每種磺胺的離子化效率達(dá)到最佳。16種磺胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖示于圖1。

圖1 16種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 The total ion current chromatogram of 16sulfonamides

2.4 線性范圍和檢出限

分別配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，16種磺胺的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)列于表2。本實驗采用空白樣品（空白牙膏樣品購于石家莊某超市，采用消炎、中草藥和防過敏3類具有消炎抗菌作用的牙膏為空白基質(zhì)）加標(biāo)法，以3倍信噪比估算檢出限（LOD），該方法檢出限為2.0mg／kg。

2.5 方法的回收率和精密度

采用3類空白樣品進(jìn)行添加回收率和精密度實驗，樣品添加不同濃度后，按1.2.2操作，用液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定，其回收率和精密度結(jié)果列于表3?？梢钥闯觯?、中、低3個添加水平（每個濃度平行測定6次）的平均回收率在81.2%～104.7% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～9.1%。

2.6 實際樣品測定

采用本方法對市場上常見的16種牙膏進(jìn)行測定，暫未發(fā)現(xiàn)有添加磺胺類藥物的情況。表明目前市場上流通的主要口腔衛(wèi)生用品符合《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007年版）的要求，消費者可放心使用。

表2 16中磺胺類藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients of 16sulfonamides

表3 16種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和精密度 （n＝6）Table 3 Recovery and precision of 16sulfonamide（n＝6）

續(xù)表

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測牙膏中磺胺類（磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺－6－甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基異噁唑、磺胺嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲異噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰）藥物含量的方法。該方法簡單快速、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于牙膏中磺胺類藥物含量的檢測與確證。

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