一步陽離子柱層析高效純化溶菌酶及其溶菌活性Δ

趙林，蔡金艷，周林，李黃金，周聯(lián)（.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣州 50006；2.廣州中醫(yī)藥大學臨床藥理研究所，廣州 50405；.廣東藥學院藥科學院，廣州 50006）

溶菌酶是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，其作用于N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，可使革蘭陽性菌細胞壁中黏多糖成分分解[1]，因而具有殺菌能力，在醫(yī)學上具有重要的應用價值。其可用于制備抗菌消炎藥、抗病毒藥，與抗菌藥物合用可以治療潰瘍、口腔和鼻腔黏膜炎，另還具有抗腫瘤、增強免疫力的藥理作用[2-4]。雖已應用多年，至今仍未出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[5]。在全球耐藥菌引起的疾病不斷爆發(fā)的情況下，溶菌酶的研究和應用越來越多地受到人們的關注。

溶菌酶廣泛存在于動植物體內和人的正常體液中，其中雞蛋清溶菌酶含量最豐富。目前溶菌酶純化方法主要有結晶、鹽析、超濾、離子交換層析法等。結晶法操作簡單、成本低，但耗時長，酶的粗制和精制分別需要1周和1月以上的時間[6]；鹽析法只能得到一定純度的產物，酶比活力不高，只有13000 U/mg[7]；超濾法工藝簡單，但濾膜容易堵塞，收率一般在50%左右[8]；層析法是獲得高純度溶菌酶的理想方法，應用較多的是陽離子交換層析法。在相關的層析研究中[9-12]，研究者較多采用靜態(tài)吸附、洗脫溶菌酶，操作繁瑣、耗時長，酶的吸附及雜質的去除效率都有待提高。本研究采用等電點沉淀結合一步陽離子交換柱層析來探索溶菌酶的高效分離純化工藝，為其實驗室制備和工業(yè)生產提供依據(jù)。

1 材料

SORVALL D-37520高速離心機（德國科竣公司）；DWD-1紫外檢測儀、FB-2型恒流泵（上海金達生化儀器公司）；Z型層析柱（上海錦華層析設備廠）；Tanon 1220凝膠成像系統(tǒng)（上海天能有限公司）；Alpha1-2凍干機（德國CHRIST公司）；BCM-100生物潔凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；Ultro-spec 1100 pro分光光度計（美國GE公司）；AUW120分析天平（日本島津公司）。

新鮮雞蛋（市售）；陽離子交換劑羧甲基-瓊脂糖凝膠（CM-Sepharose FF，美國GE公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、溴酚藍、溶菌酶標準品（批號:080622，比活力:20000 U/mg）均為廣州威佳科技有限公司產品；蛋白質低分子質量標準[寶生物工程（大連）有限公司，批號:D530A，分子質量范圍:14～97 kD]；蛋白胨、酵母粉（英國OXOID公司）；NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH、HCl、甘油均為分析純。

溶壁微球菌（廣東省微生物研究所）。

2 方法與結果

2.1 稀釋及等電點沉淀處理蛋清

取新鮮雞蛋，破殼取蛋清置于250 ml的燒杯中，加入3倍體積的0.02 mol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液（PBS，以下濃度和pH均相同）攪拌均勻。用1 mol/L HCl調節(jié)pH值至4.7，12000 r/min離心5 min。上清轉移至另一干凈燒杯中，用1 mol/L NaOH調節(jié)pH值至8.0，再次12000 r/min離心5 min。棄掉沉淀，上清經孔徑為0.20 μm的微孔濾膜過濾，濾液留用。由于蛋清中主要雜蛋白卵清蛋白的等電點為4.7，類卵黏蛋白的等電點為4.8，pH調節(jié)為4.7時形成了大量的絮狀白色沉淀，經離心除去。在pH值回調為8.0的過程中，由于雜蛋白卵轉鐵蛋白的等電點為6.6，又出現(xiàn)了絮狀沉淀，再離心除去。最后經稀釋、2次沉淀和離心、微濾處理，部分雜蛋白被除去，獲得的濾液均一、澄清，黏度大大降低，保證了下一步柱層析動態(tài)上樣的順利進行。目標產物溶菌酶留在濾液中，在pH值為8.0的條件下帶正電荷，而其他雜蛋白帶負電荷，為離子交換層析分離創(chuàng)造了條件。

2.2 利用陽離子交換劑CM-Sepharose FF柱層析純化溶菌酶

采用重力沉降法將20 ml CM-Sepharose FF陽離子交換劑均勻地裝入層析柱中。連接好蠕動泵、監(jiān)測器、記錄儀，用3倍柱床體積（CV）的PBS過柱平衡，流速為2 ml/min。待PBS剩余約5 ml時，將監(jiān)測器吸收信號調零，之后繼續(xù)平衡。平衡完畢，將“2.1”項中處理好的濾液以相同的速度上樣，結束后以2倍CV的PBS清洗。用A液（即PBS）和B液（含0.5 mol/L Na-Cl的PBS）各100 ml進行線性梯度洗脫，準確收集洗脫峰樣品。取0.5 ml測定純度，其余樣品進行低溫冷凍干燥，稱量所獲得的白色粉末。層析結果見圖1。

由圖1可以看出，基線平穩(wěn)，柱平衡良好。上樣和清洗過程所形成的穿透峰（峰1）典型，溶菌酶與交換劑的交換平穩(wěn)順暢，無過載；上樣完畢洗滌信號較易回到基線。之后采用鹽溶液梯度洗脫，只得到1個對稱狹窄的洗脫峰（峰2），表明柱效較高，樣品可能只含有單一成分，純度較高。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）測定溶菌酶純度

圖1 陽離子交換純化溶菌酶層析圖1.穿透峰；2.洗脫峰Fig 1 Cation-exchange chromatography process of lysozyme purification1.unbound fraction peak；2.elution fraction peak

圖2 SDS-PAGE檢測溶菌酶純度M.蛋白質低分子量標準；1.洗脫峰樣品；2.溶菌酶標準品Fig 2 SDS-PAGE analysis of purified lysozymeM.low molecular mass protein marker；1.sample of elution fraction peak；2.standard lysozyme

制備12%的分離膠、5%的濃縮膠，將離子交換洗脫峰樣品與溶菌酶標準品分別加入等體積的2倍蛋白上樣緩沖液，100℃水浴5 min，冷卻后各取10 μl上樣電泳。起始以20 mA的恒定電流進行電泳，當溴酚藍進入分離膠界面時，調整電流為30 mA繼續(xù)電泳至溴酚藍到達分離膠底端。剝膠，進行考馬斯亮藍染色和脫色。脫色干凈后，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照，照片經系統(tǒng)自帶的GIS 1D軟件分析條帶的光密度值和光密度百分比，從而間接反映樣品的純度。SDS-PAGE檢測溶菌酶純度結果見圖2。

由圖2可知，離子交換洗脫峰樣品經電泳后只出現(xiàn)了1條清晰的條帶，與溶菌酶標準品比較，均處于14 kD大小的位置上，證明該蛋白質為蛋清溶菌酶。其純度經GIS 1D軟件掃描分析，結果約在95%以上。洗脫峰樣品經低溫冷凍干燥后獲得237.9 mg溶菌酶粉末，所用蛋清為56.7 ml，折合收率為4.2 mg（溶菌酶）/ml（蛋清）。

2.4 溶壁濁度法檢測溶菌酶溶菌活性

以1%的接種量將溶壁微球菌接種在50 ml滅菌的LB培養(yǎng)基中，搖床（180 r/min）、37℃培養(yǎng)過夜。4000 r/min離心10 min，棄上清收集菌體。用100 ml、0.02 mol/L、pH 6.2的PBS懸浮菌體，4000 r/min離心10 min，棄上清，重復洗滌1次。之后用0.02 mol/L、pH 6.2的PBS懸浮菌體，調整450 nm波長處的吸光度值（A450）為0.6左右。稱取1 mg純化后凍干的溶菌酶粉末，用0.02 mol/L、pH 6.2的PBS制備成50 μg/ml的樣品溶液。取0.1 ml此樣品溶液和2.9 ml的細胞懸液置于比色杯中，以0.02 mol/L、pH 6.2的PBS調零，測量1 min內A450的下降值。

溶菌酶的活力單位規(guī)定為:25℃和pH 6.2的條件下，每分鐘使溶壁微球菌的A450下降0.001的酶量即為1個酶活力單位（1 U）。計算公式:酶活力（U）＝（A1－A2）/0.001。其中，A1表示450 nm波長下起始的吸光度值；A2表示450 nm波長下反應1 min后的吸光度值；酶活力（U）為參與反應的酶液所含有的總活力單位數(shù)。溶菌酶的比活力＝酶活力（U）/酶的質量（mg）。

活性檢測結果顯示，A1＝0.572，A2＝0.484，經計算0.1 ml的樣品溶液總活力單位為88 U。根據(jù)其質量濃度50 μg/ml可計算出0.1 ml樣品中溶菌酶樣品的質量為0.005 mg，結合比活力的計算公式，可算出純化的溶菌酶樣品的比活力為17600 U/mg。

3 討論

生物分離技術研究的根本任務是設計和優(yōu)化分離過程，提高分離效率，減少分離過程步驟，縮短分離操作時間，達到提高產品收率與活性、降低生產成本的目的。在溶菌酶的眾多分離方法中，存在著步驟多、效率低的問題，有必要進一步改進。層析作為一種高精度的分離純化手段，在生化藥物、基因工程重組蛋白、重組核酸等的分離純化中占據(jù)著核心的位置。層析前的預處理和層析介質的選擇、pH值、洗脫條件等是影響層析純化效率的重要因素。

本研究從雞蛋清中分離純化溶菌酶，在蛋清中除了目的蛋白溶菌酶外，還包括卵清蛋白、卵轉鐵蛋白、類卵黏蛋白、卵黏蛋白4種主要雜蛋白。卵清蛋白占了蛋白質總量的56.80%，其等電點為4.7；卵轉鐵蛋白占了13.70%，其等電點為6.6；類卵黏蛋白占了11.60%，其等電點為4.8；卵黏蛋白占3.15%，其等電點介于3.83～4.41間；而溶菌酶占蛋白質總量的3.50%，等電點為10.8，且在較寬的pH值范圍內穩(wěn)定，尤其是在堿性環(huán)境中更穩(wěn)定[13]。等電點的差異是目標蛋白與雜蛋白區(qū)別的一個重要方面，雜蛋白的等電點主要處于酸性pH值范圍內，目標蛋白的等電點處于堿性pH值范圍內。因此從等電點出發(fā)，先利用等電點沉淀，去除一部分雜質進行預處理，再結合一定pH值下電荷的差異，利用離子交換層析來精制純化，理論上應該可以得到高收率、高純度、高活性的溶菌酶。

試驗中將蛋清稀釋液的pH值調整到4.7，主要雜蛋白卵清蛋白和類卵黏蛋白被部分沉淀，之后高速離心去除。此步驟大大降低了樣品的黏度，減輕了柱層析的負擔，而溶菌酶由于其特殊的穩(wěn)定性幾乎沒有損失，達到了預處理的目的。

離子交換層析是層析分離中最常用的方法之一。為保持高的生物活性，往往采用弱陽離子或弱陰離子交換。CM-Sepharose FF為GE公司生產的一種弱陽離子交換介質，分辨率高、線型流速快、與物質結合后易被重新分開，常適合于生物活性物質的分離。研究中采用0.02 mol/L、pH為8.0的PBS來處理蛋清、平衡柱床并作為洗脫的基礎緩沖液，不僅可以保證溶菌酶的活性，而且可以使目標成分和雜質成分均帶上較多的相反電荷（其中溶菌酶帶上正電荷，其他雜蛋白帶上負電荷）。這樣經一步CM-Sepharose FF陽離子柱層析就可以獲得高純度的溶菌酶。層析圖驗證了這種情況:上樣時穿透較多且平穩(wěn)，梯度洗脫時只出現(xiàn)1個對稱且尖銳的洗脫峰，說明分辨率是較高的。SDS-PAGE結果證明該洗脫峰樣品純度達到了95%以上。由于純度較高，酶的比活力達到17600 U/mg的水平。整個純化過程只涉及到等電點沉淀和離子交換柱層析，溶菌酶損失很少，收率達到4.2 mg（溶菌酶）/ml（蛋清）的水平，比余海芬等報道[11]的3.0 mg/ml的收率高40%；且整個分離過程只需約2 h，簡潔高效，達到了縮短分離操作時間、提高產品收率與活性、優(yōu)化分離過程的目的。

綜上所述，本研究選擇CM-Sepharose FF為交換介質，將蛋清稀釋并等電點沉淀后，經一步柱層析，簡潔高效地分離得到了高活性的溶菌酶，可為實驗室制備及工業(yè)生產提供有效方法。

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