新型α-葡萄糖苷酶抑制劑類降血糖藥的合成及其活性研究Δ

王謙，邊曉麗，樊向妮，羅振吉，趙桂蘭（.西安交通大學醫(yī)學院，西安7006；2.陜西科技大學生命科學與工程學院，西安 7002）

糖尿病的主要危害是高血糖誘發(fā)血管病變進而導致多種并發(fā)癥發(fā)生[1-2]，而血糖的波動較持續(xù)性高血糖更易導致血管損傷[3-5]。餐后高血糖是導致血糖波動的主要原因之一，對于飲食結構以碳水化合物為主的亞洲人群更為突出。α-葡萄糖苷酶抑制劑（α-Glucosidase inhibitor，α-GI）通過延緩碳水化合物的分解而降低餐后高血糖，對于控制餐后血糖波動及其糖尿病并發(fā)癥具有其獨特的優(yōu)勢。尋找新型α-GI成為抗糖尿病藥物研究的熱點之一[6]。本課題組在設計合成新型α-GI的研究中發(fā)現(xiàn)，具有取代基的酞酰亞胺類化合物（如圖1中的化合物1）具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制活性（另文報道）。為了增加水溶性，在4-硝基酞酰亞胺的氮上引入吡喃葡萄糖基，合成了氮苷化合物5-硝基-2-（β-D-吡喃葡萄糖基）-1H-異吲哚-1，3二酮（5-nitro-2-（β-D-glucopyranosyl）-1H-isoindole-1，3-dione，化合物2，即目標化合物），對其α-葡萄糖苷酶抑制活性及降低餐后血糖活性進行了研究，以為開發(fā)新型α-GI奠定了基礎。

具有抑酶活性的酞酰亞胺類化合物的結構通式見圖1。

1 材料

X-5數(shù)字顯示顯微熔點測定儀（鄭州澤銘科技有限公司）；Bruker AVANCEⅡ300型核磁共 振（NMR）儀 、API-QTRAP 3200液相色譜-質譜（MS）聯(lián)用儀（日本島津制作所）；羅氏血糖儀（德國羅氏診斷公司）。

α-葡萄糖苷酶（來源于酵母，加拿大Bio Basic Inc公司，批號：201004AX，活力：42U/mg）；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNP-G，美國Sigma公司，批號：2009J03T4，純度：＞99.5%）；阿卡波糖片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：201001040002，規(guī)格：每片100mg）；酞酰亞胺、無水葡萄糖均為分析純；合成所用其他化學試劑均為市售分析純或化學純。

昆明小鼠，♂，動物合格證號：陜動證字08-004，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

羅氏血糖試紙（德國羅氏診斷公司，批號：201007050411）；葡萄糖測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20100924）。

圖1 具有抑酶活性的酞酰亞胺類化合物的結構通式Fig 1 Structure of phthalimide compound with enzyme inhibition activity

2 方法與結果

2.1 目標化合物的合成

2.1.1 4-硝基酞酰亞胺鉀鹽的合成。

以鄰苯二甲酰亞胺（化合物3）為原料，按文獻[7]方法制備4-硝基酞酰亞胺鉀鹽（化合物5），合成路線見圖2。

圖2 4-硝基酞酰亞胺鉀鹽的合成路線Fig 2 Synthetic route of 4-nitro phthalimidopotassium

2.1.2 目標化合物的合成。

合成路線見圖3。

2.1.3 目標化合物的合成方法。

圖3 目標化合物的合成路線Fig 3 Synthetic route of target compound

（1）2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃溴代葡萄糖（化合物7）的制備：于100ml三口瓶中加入乙酸酐30ml（273.2mmol），冷卻至5℃，攪拌下加入高氯酸數(shù)滴。室溫升高至30℃，分批加入葡萄糖（并保持溫度不超過40℃），室溫攪拌至澄清。將反應混合物降溫至20℃以下，加入紅磷4.5g（36.1mmol），滴加2ml溴水，其間控制滴加速度，使混合物溫度不超過20℃，室溫攪拌3h。向反應瓶中加入60ml氯仿，抽濾，濾液中加入50g碎冰，待冰全部溶化后轉入分液漏斗中，分出有機層，并用氯仿萃取2次。合并氯仿層，依次用水、飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉洗滌。氯仿層用無水硫酸鈉干燥。55℃減壓蒸除溶劑，得到微黃色油狀物。將所得油狀物溶于20ml乙醚中，加入石油醚（15ml），漸漸析出白色沉淀。靜置過夜，抽濾得到白色固體14.05g，收率為81.5%，熔點（mp）為87～88℃（文獻[8]值：88～89℃）。

（2）5-硝基-2-（2′，3′，4′，6′-O-四乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基）-1H-異吲哚-1，3（2H）二酮（化合物8）的制備：于100ml三口瓶中加入3g化合物5（13mmol）和20mlN，N-二甲基甲酰胺（DMF），攪拌0.5h后，滴加化合物7的DMF溶液。滴加完畢后，邊攪拌邊升溫至80℃，反應55min后DMF基本澄清。降至室溫，抽濾除去反應生成的KBr。減壓蒸干DMF，得到黃色固體，經(jīng)石油醚-乙酸乙酯（8∶1）重結晶，得黃色晶體3.3g，收率為82.4%，mp為155～156℃，1H-NMR[二甲基亞砜（DMSO）]，δ：H2.02～2.11（m，12H，CH3），3.72～3.76（m，1H，GH-5），4.09～4.23（m，2H，GH-6），5.01～5.23（m，4H，GH1-4，J1，2＝8.5），8.39（d，1H，ArH），8.62（d，1H，ArH），9.07（s，1H，ArH）。

（3）目標化合物的合成：取3g化合物8（6mmol）于40ml無水甲醇中，攪拌下滴加0.5mol/L甲醇鈉（2.4ml），10min后溶液開始變混濁，有沉淀析出，置于冰箱過夜，收集析出物，干燥得粗品2.2g，用無水乙醇重結晶，得白色粉末2.0g，收率為68.5%，mp為188～190℃，m/z：354.03，1H-NMR（DMSO），δ：2.2（s，4H，4×OH），3.732～3.78（m，1H，GH-5），4.09～4.23（m，2H，GH-6），5.03～5.24（m，4H，GH1-4，J1，2＝8.4），8.40（d，1H，ArH），8.63（d，1H，ArH），9.07（s，1H，ArH）。

葡萄糖經(jīng)乙?；颁寤玫?，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃溴代葡萄糖（化合物7），經(jīng)烴化反應將其引入到4-硝基酞酰亞胺的氮上得到對應的葡萄糖氮苷（化合物8），去乙?；蟮玫侥繕嘶衔?，其結構經(jīng)NMR及1H-NMR等得以確證。

2.2 對酵母α-葡萄糖苷酶和鼠腸α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究

2.2.1 對酵母α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

反應體系：α-葡萄糖苷酶溶液10U/ml（10μl），PNP-G溶液20μmol/ml（10μl），加入化合物2溶液（濃度為1mmol/ml），體積分別為10、20、30、40、50μl?；衔?溶液以DMSO-磷酸鹽緩沖溶液（1∶9）混合溶液為溶劑，最后加入終止劑碳酸鈉，總體積為100μl。阿卡波糖為陽性對照，質量濃度為20mg/ml（參照文獻[9]），加入體積分別為10、20、30、40、50μl；同時以α-葡萄糖苷酶溶液、PNP-G溶液、緩沖溶液以及終止劑的混合液為空白對照。

具體操作過程：取酶液10μl于37℃溫孵30min，分別加入濃度為1mmol/ml的化合物2溶液10、20、30、40、50μl，混勻后于37℃保溫10min，再加入PNP-G 5μl，37℃保溫10min后，加入終止劑混勻。吸取20～40μl反應試液，稀釋至3ml后，在400nm波長處測定溶液吸光度，計算抑制率（IR，%），以產(chǎn)生50%抑制活性時對應的化合物濃度值（半數(shù)抑制濃度，IC50）表示抑制劑的活性，并用Xlfit軟件中的4Parameter Logistic Model計算IC50值。IR＝（A0－A1）/A0×100%，A0為未加抑制劑的吸光度，A1為加入酶抑制劑后的吸光度。

2.2.2 對鼠腸α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

（1）小鼠小腸黏膜酶液的制備。小鼠禁食不禁水12h后處死，快速切取完整的結腸，去除系膜組織和十二指腸，用冷生理鹽水沖洗腸腔，除去內容物。將漂洗后的腸段用冷生理鹽水漂洗干凈后，用玻片小心刮取黏膜組織，于冰浴中制備勻漿。然后以10000r/min離心10min，取上清液、分裝、快速冰凍，－20℃冰箱保存。（2）抑酶活性測定。取0.1ml小鼠小腸酶液37℃下孵育15min，加入濃度為1mmol/ml的化合物2溶液10、30、50、70、90μl后，繼續(xù)保溫30min，分為3組：分別加入50μl 0.05mol/L的麥芽糖、乳糖和淀粉，在37℃水浴中準確反應60min后，即入沸水浴終止反應；同時做空白對照，即另取0.1ml小鼠腸酶液，在沸水中加熱滅活后，加入50μl 0.05mol/L的麥芽糖、乳糖和淀粉，其余步驟同上。取反應液10μl于EP管中，再加入葡萄糖測試盒中A試液500μl、B試液500μl后混勻，37℃下保溫10min。取此反應試液50μl，稀釋至3ml，于505nm波長下測定其吸光度。按照試劑盒方法計算葡萄糖的生成量。以阿卡波糖為陽性對照，加入的質量濃度為20mg/ml，體積為10、30、50、70、90μl；同時設定空白對照。按下式計算IR，并根據(jù)IR計算IC50值：IR＝（樣品組葡萄糖含量/空白對照組葡萄糖含量）×100%。

抑酶活性測定結果顯示，化合物2對酵母α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出明顯的抑制活性，其IC50遠小于阿卡波糖；對鼠腸α-葡萄糖苷酶的麥芽糖酶的抑制作用明顯，對乳糖酶的抑制作用次之，而對淀粉酶的抑制活性較弱。表明化合物2抑制α-葡萄糖苷酶、麥芽糖酶和乳糖酶的活性較阿卡波糖強，具體詳見表1。

表1 目標化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性結果（n＝3）Tab 1 Enzyme inhibition activity of target compound on α-glucosidase（n＝3）

2.3 對小鼠餐后血糖的影響[10]

取正常小鼠，禁食不禁水12h，篩選出空腹血糖水平為4.0mmol/L左右的小鼠，隨機分為3組，每組10只?？瞻捉M：淀粉（2g/kg）；受試藥物（化合物2）組：淀粉（2g/kg）+化合物2（25mg/kg）；阿卡波糖組：淀粉（2g/kg）+阿卡波糖（25mg/kg）。分別在灌胃后0.5、1.0、2.0h尾靜脈取血測定血糖，初步觀察化合物2對小鼠餐后血糖的影響。經(jīng)統(tǒng)計學處理結果顯示，受試藥物（化合物2）組與空白組和阿卡波糖組比較均有顯著性差異，表明化合物2能降低餐后血糖水平，但其降低血糖活性不及陽性對照藥阿卡波糖，詳見表2及圖4。

表2 各組小鼠餐后血糖水平比較Tab 2 Comparison of postprandial blood glucose of mice in each group

圖4 各組小鼠餐后血糖水平比較曲線Fig 4 Comparison of postprandial blood glucose curves of mice in each group

3 討論

葡萄糖在1位成苷鍵時，可能有α型和β型2種構型：在β構型中，H1和H2都處于a鍵，二者之間的偶合常數(shù)通常在8～13之間；而α構型時H1和H2分別處于e鍵和a鍵，二者之間的偶合常數(shù)較小，通常在2～6之間。根據(jù)文獻[9]方法制備2，3，4，6-四-O-乙?；?α-D-吡喃溴代葡萄糖，當4-硝基酞酰亞胺鉀鹽與其反應時，從β位進攻得到β型構型產(chǎn)物，產(chǎn)物的偶合常數(shù)也證明其構型為β型。

越來越多的臨床及實驗研究[11]表明，餐后高血糖導致的血糖波動已成為多種糖尿病并發(fā)癥尤其是心血管疾病發(fā)病的獨立危險因素。α-GI通過阻斷碳水化合物在腸道的分解，延緩葡萄糖的生成和吸收，減緩餐后血糖波動，對于控制糖尿病并發(fā)癥的獨特優(yōu)勢越來越突出。本文在前期對酞酰亞胺類衍生物研究的基礎上，合成了化合物2，體外抑酶活性測定結果表明，該化合物對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用，尤其是對酵母α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出較低的IC50值。對鼠腸α-葡萄糖苷酶，該化合物主要是抑制雙糖酶（麥芽糖酶、乳糖酶），對淀粉酶活性較差。通過計算機輔助藥物設計軟件進行Docking分析顯示，該分子與α-葡萄糖苷酶蛋白活性催化區(qū)域的氨基酸殘基間可形成多個氫鍵，從分子水平闡明化合物2對α-葡萄糖苷酶的抑制作用提供了依據(jù)，詳見圖5。

圖5 α-葡萄糖苷酶活性位點與化合物2的氫鍵結合示意圖Fig 5 Hydrogen bond binding mode of compound 2and the active site of α-glucosidase

由于飲食中的碳水化合物（多糖）被水解后主要以麥芽糖和異麥芽糖為主，因此對麥芽糖酶抑制活性更強的化合物，更有利于控制餐后葡萄糖的生成[12]。體外抑酶活性預示化合物2可能具有降低餐后血糖的活性。但通過初步研究該化合物對正常小鼠餐后血糖的作用，發(fā)現(xiàn)該化合物的體內降血糖活性不及阿卡波糖，可見其體外較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性在正常小鼠體內并未顯現(xiàn)。其原因可能是多方面的，例如，動物模型的選擇、給藥方式等。本研究只初步觀察了對正常小鼠進食（淀粉）時血糖的影響，而對糖尿病時鼠小腸α-葡萄糖苷酶高表達情況下的作用有待進一步探索[12]。阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性較好，而目標化合物主要抑制雙糖酶，對淀粉酶活性較差，在顯效時序上也有差別?；衔矬w內顯效受眾多因素的影響，如在消化道的穩(wěn)定性、對靶酶的親和性等，也不排除體外活性假陽性的可能。由于體外α-葡萄糖苷酶為游離狀態(tài)，而α-葡萄糖苷酶在跨越小腸上皮細胞雙分子層時被多肽鏈錨定在膜上，N端向內，C端向外，這樣如果體外試驗中α-GI作用于游離α-葡萄糖苷酶的N端，則檢測到的體外抑制活性不能在體內重現(xiàn)。筆者就可能的影響因素將做進一步的實驗探討，為該化合物的進一步開發(fā)應用及設計活性更強、性能更優(yōu)良的α-GI提供實驗依據(jù)。

綜上所述，本文合成了一種新的葡萄糖氮苷化合物5-硝基-2-（β-D-吡喃葡萄糖基）-1H-異吲哚-1，3二酮，其對α-葡萄糖苷酶尤其是雙糖酶具有強體外抑制活性，但體內降低正常小鼠餐后血糖活性不及阿卡波糖。

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