注射用鹽酸吉西他濱細菌內(nèi)毒素檢查方法的研究

周 梅，武 谷（安徽省食品藥品檢驗所，合肥 230051）

鹽酸吉西他濱全稱為2′-脫氧-2′，2-二氟胞嘧啶鹽酸鹽（β異構體），其結構與阿糖胞苷類似，是新一代抗代謝藥。鹽酸吉西他濱作為一種前藥在細胞內(nèi)是脫氧胸苷激酶磷酸化的良好底物。注射用鹽酸吉西他濱（β異構體）為注射用無菌凍干粉末，用于治療局部晚期或已轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌[1]?，F(xiàn)有國家標準采用熱原方法進行其生物安全性質(zhì)量檢查。筆者按照《中國藥典》2010年版（二部）“細菌內(nèi)毒素檢查法”[2]，對注射用鹽酸吉西他濱進行了細菌內(nèi)毒素檢查方法的研究，以探討其代替熱原檢查法的可行性。

1 材料

1.1 儀器

S648恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械七廠）；HS-1300凈化工作臺（蘇凈集團安泰公司）；MS3digital旋渦混旋器（德國IKA公司）；試驗所用容器和用具均經(jīng)250℃干烤2 h。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸吉西他濱（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：20100924、20100925、20100926，規(guī)格：每支0.2 g）；細菌內(nèi)毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-200966，規(guī)格：每支120 EU）；鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號：10103012；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：1106010；靈敏度：均為0.25 EU/ml）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET，福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：10060321，規(guī)格：每支100 ml）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核

用BET將細菌內(nèi)毒素工作標準品溶解，置于混旋器混合15 min，然后制成0.5、0.25、0.125、0.062 6 EU/ml的稀釋液，依據(jù)《中國藥典》[2]2010年版二部附錄方法[2]進行復核試驗。結果，鱟試劑靈敏度的測定值（λc）均在0.5λ～2λ之間，表明所用鱟試劑均可用于細菌內(nèi)毒素檢查，結果詳見表1（表中“+”表示凝膠形成，“-”表示凝膠未形成）。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果Tab1 TALsensitivity check results

2.2 細菌內(nèi)毒素理論限值的確定[3]

參考注射用鹽酸吉西他濱的說明書，其臨床使用最大劑量為1 250 mg/m2（人的體表面積按1.62 m2計），因此M（M為人用每千克體質(zhì)量每小時的最大供試品劑量）定為1 250×1.62/60（kg·h）；內(nèi)毒素限值（L）按公式L＝K/M（K為人每千克體質(zhì)量每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量）計算：L＝5 EU/（kg·h）×60 kg×1 h/1 250/1.62 mg＝0.148 EU/mg。根據(jù)《中國藥典》2010年版（二部）“化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則”要求[2]，細菌內(nèi)毒素檢查限值按規(guī)定要求計算，由于藥物和適應證（如抗感染、抗腫瘤、心血管藥等急重病癥用藥，兒童老人用藥，復合用藥，大輸液等）的不同，限值可適當嚴格，即至計算值的1/3～1/2，以保證安全用藥。因此將注射用鹽酸吉西他濱細菌內(nèi)毒素理論限值確定為每1 mg吉西他濱中含細菌內(nèi)毒素的量不得過0.10 EU。

2.3干擾試驗最小有效稀釋質(zhì)量濃度c（mg/ml）的計算

根據(jù)公式：最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）＝cL/λ，并考慮到目前市售鱟試劑有0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.03 EU/ml 5種靈敏度，對于規(guī)格為0.2 g的樣品MVD0.5-0.03＝0.14 EU/mg×200 mg/ml/（0.5～0.03）EU/ml＝56倍～933倍，則該品種最小有效稀釋質(zhì)量濃度c為3.57～0.214 mg/ml。

2.4 內(nèi)毒素標準品的稀釋

用BET將細菌內(nèi)毒素工作標準品稀釋成0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU/ml系列內(nèi)毒素溶液備用，作為Es系列。

2.5 供試品的干擾預試驗[4]

為確定注射用鹽酸吉西他濱對方法的影響，首先采用直接稀釋法進行供試品干擾預試驗。用BET將樣品溶解，制備成不同質(zhì)量濃度的溶液：0.25、0.5、1.0、2.0、3.5、7.0 mg/ml溶液，記為SW系列；另再分別制備1份同樣質(zhì)量濃度的供試品溶液，在制備中加入內(nèi)毒素工作標準品，使每一水平的樣品溶液中含2λc的內(nèi)毒素，記為SE系列。選用靈敏度λc為0.25 EU/ml的鱟試劑分別與SW和SE反應，相應得供試品陰性對照（NPC）系列和供試品陽性對照（PPC）系列，每一稀釋質(zhì)量濃度平行做2個反應管，同時做BET陰性對照（NC）和陽性對照（PC）。結果發(fā)現(xiàn)，如果采用直接稀釋法，即使將供試品稀釋至0.25 mg/ml時對細菌內(nèi)毒素和鱟試劑的反應也有干擾。

取注射用鹽酸吉西他濱1支，加BET 10 ml，搖勻，測其pH值為3.07。由于細菌內(nèi)毒素檢查試驗pH值最佳范圍為6.0～8.0，因此將上述溶液調(diào)節(jié)pH值在6.0～8.0之間，再進行干擾預試驗。稱取碳酸鈉適量置于無菌容器中，加BET制備成1 mol/L的溶液；取注射用鹽酸吉西他濱1支，加BET 10 ml，搖勻，取碳酸鈉溶液適量加入此溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再進行干擾預試驗，結果見表2。

表2 供試品干擾預試驗結果Tab2 Results of interference pretest of samples

表2結果表明，供試品質(zhì)量濃度在0.25～3.5 mg/ml時對細菌內(nèi)毒素和鱟試劑的反應未見干擾，故取供試品質(zhì)量濃度為3.5 mg/ml進行干擾試驗以進一步驗證。

2.6 供試品干擾試驗

取注射用鹽酸吉西他濱1支，加BET 10 ml，搖勻，取1 mol/L的碳酸鈉溶液適量加入此溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再用BET稀釋至3.5 mg/ml。采用2個不同廠家的鱟試劑，按2010年版《中國藥典》（二部）附錄[2]方法進行試驗，結果見表3。

表3 供試品干擾試驗結果Tab3 Results of interference test of samples

從表3結果可知，上述供試品的Et均在0.5Es～2.0Es之間，即供試品質(zhì)量濃度在3.5 mg/ml時與2個廠家的鱟試劑試驗均不產(chǎn)生干擾。根據(jù)公式MVD＝cL/λ，當供試品為注射用無菌粉末時MVD取1，計算此時L值為0.07 EU/mg，低于確定的理論值。因此可采用L值為0.10 EU/mg對注射用鹽酸吉西他濱進行細菌內(nèi)毒素檢查。

2.7 樣品細菌內(nèi)毒素檢查

取注射用鹽酸吉西他濱1瓶，加BET 10 ml溶解，再加碳酸鈉溶液適量（調(diào)pH至7.0），用BET將樣品稀釋成2.5 mg/ml（L值為0.10 EU/mg）的溶液，用靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑檢查，結果見表4。

表4 樣品中細菌內(nèi)毒素檢查結果Tab4 Results of endotoxin detection of samples

表4檢測結果顯示，樣品中細菌內(nèi)毒素含量均低于0.10 EU/mg。

3 討論

細菌內(nèi)毒素檢查法是通過鱟試劑與細菌內(nèi)毒素間產(chǎn)生凝聚反應以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定的一種方法，其具有操作簡單、檢測周期短、靈敏度高、結果準確等優(yōu)點，可替代家兔熱原檢查法用于注射液的質(zhì)量控制。由于不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑的抗干擾能力存在差別，為保證試驗結果的可靠性，該試驗一般選擇2個廠家生產(chǎn)的鱟試劑對樣品進行干擾試驗。通過預試驗發(fā)現(xiàn)，本品對鱟試劑凝集反應具有較強的抑制作用，僅通過稀釋的方法不能排除干擾。為此，筆者分析了該藥的組成及溶液的pH值。由于本品的主要成分為鹽酸吉西他濱，輔料為甘露醇、醋酸鈉和氫氧化鈉，測其pH值為3.07，而適合鱟試劑反應水平的pH值范圍為6.0～8.0，藥物pH值偏酸或偏堿，超出了鱟試劑緩沖能力就會抑制或促進凝聚的形成。因此，本試驗采用1 mol/L的碳酸鈉溶液調(diào)pH值至7.0。結果表明調(diào)pH值后再稀釋至3.5 mg/ml時就可以排除本品對鱟試劑凝集反應的干擾作用。因此將L值定為0.10 EU/mg，并認為注射用鹽酸吉西他濱采用細菌內(nèi)毒素檢查法代替家兔熱原檢查法進行生物安全性質(zhì)量檢查是可行的。

[1]金薇，楊永健.高效毛細管電泳分離和測定注射用鹽酸吉西他濱中有關物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2004，24（5）：476.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010年：附錄99-102.

[3]國家藥典委員會.臨床用藥須知：二部[S].2000年版.北京：化學工業(yè)出版社，2000：573.

[4]葉青，王偉，迪麗努爾·沙比托夫.鹽酸多巴胺注射液細菌內(nèi)毒素檢查方法的研究[J].中國藥房，2010，21（41）：3 918.