偏執(zhí)型精神分裂癥患者GRIN1基因-855 G/C與-1140 G/A位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性

李忠杰 ，丁 梅 ，龐 灝 ，孫雪菲 ，邢佳鑫 ，宣金鋒 ，王保捷

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001；2.張家港市公安局，江蘇 張家港 215600）

谷氨酸（Glu）為哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)系統(tǒng)多種重要功能的調(diào)節(jié)，谷氨酸對(duì)于學(xué)習(xí)、記憶及神經(jīng)傳導(dǎo)等有著重要的作用，其傳導(dǎo)通路發(fā)生異常時(shí)，可能會(huì)引發(fā)精神疾病[1]。精神分裂癥（schizophrenia，SP）為一組病因不明的疾病，臨床表現(xiàn)以思維過(guò)程松散、不合邏輯的聯(lián)想、荒謬的妄想、情感不恰當(dāng)或平淡和社會(huì)功能缺損為主要癥狀[2]。精神分裂癥是法醫(yī)學(xué)鑒定的重要內(nèi)容之一，除一定的環(huán)境因素影響外，其發(fā)病的遺傳學(xué)因素也得到了明確的證實(shí)，許多神經(jīng)遞質(zhì)與精神分裂癥的關(guān)系已有報(bào)道，可能為精神分裂癥的診斷或法醫(yī)學(xué)鑒定提供客觀的參考指標(biāo)。

鑒于已知的GRIN1基因（谷氨酸受體基因之一）啟動(dòng)子區(qū)域單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)在中國(guó)人群中數(shù)據(jù)較少，國(guó)際上已有GRIN1基因SNP位點(diǎn)與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究[3-4]，本研究應(yīng)用PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)結(jié)合PAGE法，分析中國(guó)北方漢族健康無(wú)關(guān)個(gè)體與精神分裂癥患者GRIN1基因5′端-855 G/C和-1140 G/A兩個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，并探討其與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)性，為法醫(yī)學(xué)鑒定提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)照組：183例中國(guó)北方漢族健康無(wú)關(guān)個(gè)體血液樣本（男性86例，女性97例），由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院血清學(xué)教研室提供（問(wèn)卷調(diào)查三代內(nèi)無(wú)精神疾?。?/p>

實(shí)驗(yàn)組：172例偏執(zhí)型精神分裂癥患者血液樣本（男性80例，女性92例）收集自遼寧省第三人民醫(yī)院。精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)符合美國(guó)精神病學(xué)會(huì)《精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)（第 4版）》（DSM-Ⅳ）和《中國(guó)精神障礙分類(lèi)與診斷標(biāo)準(zhǔn)（第3版）》（CCMD-3）。血液樣本采集遵循知情同意原則。

1.2 方法

常規(guī)酚-氯仿法抽提DNA。擴(kuò)增引物由TaKaRa公司合成，正向引物：5′-GGGGCGTTTGCTGTTAGGTC-3′；反向引物：5′-CGGAACATCTGCTCGTGCTT-3′。PCR 反應(yīng)總體系為 20 μL，包括模板 5～10 ng，2×GC緩沖液Ⅰ（Mg2+Plus） 10 μL，dNTP 16 nmol，正反向引物各4pmol。rTaq聚合酶（TaKaRa公司）1U。擴(kuò)增條件：94℃ 1min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，循環(huán)30次；72℃ 2min，4℃保溫。

限制性?xún)?nèi)切酶處理與分型：（1）-855 G/C酶切體系為 20μL，含 2μL 10×NEB 緩沖液 2，1U 限制性?xún)?nèi)切酶BseRⅠ，2μL PCR產(chǎn)物，充分混勻后37℃反應(yīng)2h。反應(yīng)產(chǎn)物用T=6%、C=3.3%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯帶。（2）-1140 G/A 酶切體系為 20μL，含2 μL 10×NEB 緩沖液 2，1 U 限制性?xún)?nèi)切酶 BsaJⅠ，2μL PCR產(chǎn)物，充分混勻后60℃反應(yīng)2h。反應(yīng)產(chǎn)物用T=6%、C=5%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯帶[5]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率，進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間基因型和等位基因頻率分布的差異用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 -855 G/C與-1140 G/A位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分布

在-855 G/C位點(diǎn)中，檢出3種基因型：GG、GC、CC；在-1140 G/A位點(diǎn)中，檢出2種基因型：GG、GA。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，所調(diào)查的數(shù)據(jù)基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05）。

2.2 -855 G/C、-1140 G/A位點(diǎn)遺傳多態(tài)性在兩組中的分布及比較

-855 G/C、-1140 G/A位點(diǎn)遺傳多態(tài)性在兩組中的分布及比較見(jiàn)表1～2。-855 G/C位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分布在組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；-1140 G/A位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分布在組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組基因型GG的頻率低于對(duì)照組7.11%，實(shí)驗(yàn)組等位基因A的頻率高于對(duì)照組3.56%（P＜0.05）。

按性別分類(lèi)比較，-855 G/C位點(diǎn)基因型分布在女性組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組基因型GG的頻率高于對(duì)照組14.18%，實(shí)驗(yàn)組等位基因G的頻率高于對(duì)照組6.55%。-1140 G/A位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分布在女性組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組基因型GG的頻率低于對(duì)照組8.70%，實(shí)驗(yàn)組等位基因A的頻率高于對(duì)照組4.35%。然而，-855 G/C位點(diǎn)和-1140 G/A位點(diǎn)基因型分布在男性組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 -855 G/C位點(diǎn)遺傳多態(tài)性在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中的分布 ［n（%）］

表2 -1140 G/A位點(diǎn)遺傳多態(tài)性在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中的分布 ［n（%）］

3 討 論

人類(lèi)GRIN1基因位于9q34.3，共有22個(gè)外顯子，全長(zhǎng)約31kb，其基因表達(dá)產(chǎn)物調(diào)控早期大腦發(fā)育突觸的形成、維持等。谷氨酸系統(tǒng)活動(dòng)異常能影響神經(jīng)元的可塑性和引起神經(jīng)毒性[1]。一般來(lái)講，基因的啟動(dòng)子區(qū)域（5′端非翻譯區(qū)）是調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯的重要靶點(diǎn)，其內(nèi)部序列的變異可能影響基因表達(dá)產(chǎn)物功能蛋白量的變化。本研究的-855 G/C、-1140 G/A兩個(gè)SNP位點(diǎn)位于該基因的5′端非翻譯區(qū)。結(jié)果顯示，-855 G/C位點(diǎn)在女性組間基因型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；-1140 G/A位點(diǎn)在組間以及女性組間的基因型和等位基因頻率分布差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)可能是相應(yīng)的堿基替換影響了轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而編碼受體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，也可能引起谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生量的變化，具體機(jī)制有待深入研究。

Hung等[4]利用PCR-SSCP和RFLP的方法研究了GRIN1啟動(dòng)子區(qū)域的-855 G/C和-1140 G/A，結(jié)果這兩個(gè)SNP位點(diǎn)沒(méi)有顯示出與精神分裂癥的遺傳關(guān)聯(lián)性。Begni等[6]對(duì)意大利人群的研究證實(shí)GRIN1基因上-855 G/C多態(tài)性與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)，提出GRIN1可能是精神分裂癥敏感的候選基因之一。Zhao等[7]檢測(cè)了中國(guó)漢族群體5個(gè)GRIN1基因的SNP，發(fā)現(xiàn)位于5′非翻譯區(qū)-855 G/C位點(diǎn)的C等位基因在實(shí)驗(yàn)組中高頻表達(dá)，提示-855 G/C是精神分裂癥候選SNP位點(diǎn)。Galehdari等[8]采用PCR-RFLP法研究了GRIN1基因啟動(dòng)子區(qū)-855 G/C在伊朗人群中的多態(tài)性分布，通過(guò)病例對(duì)照研究揭示該位點(diǎn)多態(tài)性分布與精神分裂癥很強(qiáng)的相關(guān)性，進(jìn)而提出，C等位基因與精神分裂癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)。研究[9]提示，不同的結(jié)果可能是人群的遺傳異質(zhì)性造成。

在本研究中，按性別分類(lèi)統(tǒng)計(jì)比較后，-855 G/C位點(diǎn)基因型分布在女性組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），推測(cè)-855 G/C位點(diǎn)單堿基突變可能在精神分裂癥的發(fā)生中起到一定的調(diào)控作用。GRIN1基因啟動(dòng)子區(qū)域的-1140 G/A位點(diǎn)基因突變可能與精神分裂癥發(fā)生的遺傳病因?qū)W有關(guān)，同時(shí)，精神分裂癥發(fā)生的遺傳學(xué)因素可能存在性別傾向。人類(lèi)精神疾病的發(fā)生有環(huán)境因素與遺傳學(xué)傾向，多基因座的綜合分析研究應(yīng)是揭示精神疾病發(fā)病原因的有效途徑。

[1]李忠杰，王保捷，丁梅，等.谷氨酸受體基因單核苷酸多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（5）：369-374，377.

[2]趙靖平.精神分裂癥[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：9.

[3]VanDongen AM，VanDongen HM.Effects of mRNA untranslated regions on translational efficiency of NMDA receptor subunits[J].Neurosignals，2004，13（4）：194-206.

[4]Hung CC，Chen HY，Chen CH.Systematic mutation analysis of the human glutamate receptor，ionotropic，N-methyl-D-aspartate 1 gene （GRIN1） in schizophrenic patients[J].Psychiatr Genet，2002，12（4）：225-230.

[5]李忠杰，王保捷，丁梅，等.GRIN1基因-855 G/C和-1140 G/A 位點(diǎn)遺傳多態(tài)性[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（3）：217-218.

[6]Begni S，Moraschi S，Bignotti S，et al.Association between the G1001C polymorphism in the GRIN1 gene promoter region and schizophrenia[J].Biol Psychiatry，2003，53（7）：617-619.

[7]Zhao X，Li H，Shi Y，et al.Significant association between the genetic variations in the 5′end of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit gene GRIN1 and schizophrenia[J].Biol Psychiatry，2006，59（8）：747-753.

[8]Galehdari H，Pooryasin A，F(xiàn)oroughmand A，et al.Association between the G1001C polymorphism in the GRIN1 gene promoter and schizophrenia in the Iranian population[J].J Mol Neurosci，2009，38（2）：178-181.

[9]Schork NJ，Greenwood TA，Braff DL.Statistical genetics concepts and approaches in schizophrenia and related neuropsychiatric research[J].Schizophr Bull，2007，33（1）：95-104.