滁菊活性成分的低溫浸提及其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

孫艷輝，李京皖，賈小麗，龔建國(guó)

(1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州239012;2.滁州市金玉滁菊生態(tài)科技有限公司，安徽滁州239000)

滁菊(Chuju Chrysanthemum morifolium)是菊科菊屬的一個(gè)栽培種，是安徽省滁州的傳統(tǒng)特產(chǎn)，又名“甘菊”、“白菊”等，為中國(guó)“四大名菊”之一，已通過(guò)中國(guó)名牌農(nóng)產(chǎn)品和地理標(biāo)志產(chǎn)品認(rèn)證。滁菊性溫和，氣味清香，既可入藥，又可作清涼飲料［1］。滁菊富含黃酮類(lèi)化合物和多酚類(lèi)化合物等有效成分［2］。黃酮和多酚類(lèi)物質(zhì)多具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，在治療餐后高血糖癥、提高糖耐量和緩解高胰島素血癥等方面具有潛力［3］。已有的報(bào)道多集中在對(duì)滁菊總黃酮的提取分離純化等方面［4-6］，而對(duì)以制備滁菊飲料為目的提取工藝研究及其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。高溫浸提可提高生產(chǎn)效率和提取率，是活性成分提取過(guò)程中經(jīng)常采用的工藝。高溫浸提條件下，有益物質(zhì)大量溶出的同時(shí)，一些在低溫下不易溶出的蛋白質(zhì)、果膠等雜質(zhì)也被大量溶出，增加提取液過(guò)濾難度，并且更容易引起茶飲料的冷后渾濁。另外，高溫浸提不但增加了能耗，而且不利于浸出茶汁色澤保持［7-8］。低溫浸提可以避免這些問(wèn)題的發(fā)生，同時(shí)減少了生產(chǎn)成本［9］。因此，本研究采用單因素及正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，探討滁菊低溫浸提工藝，同時(shí)考察滁菊浸提液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，為滁菊飲料產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滁菊 由滁州市金玉滁菊生態(tài)科技有限公司提供，4℃保存;α-葡萄糖苷酶 上海佳和生物科技有限公司;pNPG 美國(guó)Sigma公司;蘆丁 標(biāo)準(zhǔn)分析品，中國(guó)藥品生物制品檢定所;焦性沒(méi)食子酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、七水硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

JJ200型電子天平 美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司;721型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器表有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市瑞爾電器有限公司;玻璃儀器氣流烘干器 長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 滁菊的低溫浸提 滁菊干燥粉碎過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的滁菊，按比例加入純水，在一定溫度下振蕩提取一定時(shí)間，抽濾，將濾液定容，得到提取液。

1.2.2 滁菊總黃酮及總多酚得率的測(cè)定

1.2.2.1 總黃酮及總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 總黃酮含量測(cè)定［10-11］采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，以蘆丁為標(biāo)樣，在510nm處測(cè)定，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為:A1=0.1876C1-0.014，R2=0.9998，式中 A1為樣品在510nm處的吸光度，C1為樣品濃度(mg/mL)。

總多酚含量測(cè)定［12-13］采用酒石酸亞鐵比色法，以焦性沒(méi)食子酸為標(biāo)樣在540nm處測(cè)定，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為:A2=0.3208C2-0.0154，R2=0.9992。式中A2為樣品在540nm處的吸光度，C2為樣品濃度(mg/mL)。

1.2.2.2 總黃酮及總多酚得率的測(cè)定 對(duì)1.2.1中的提取液按1.2.2.1方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總黃酮類(lèi)物質(zhì)、總多酚含量，并按式(1)、式(2)計(jì)算得率。

式中，V1為供試液體積(mL)，C1為樣品濃度(mg/mL)，m為滁菊粉末質(zhì)量(g)，2.5為測(cè)定時(shí)吸取提取液的體積(mL)。

式中，V2為供試液體積(mL)，C2為樣品濃度(mg/mL)，m為滁菊粉末質(zhì)量(g)，5為測(cè)定時(shí)吸取提取液的體積(mL)。

1.2.3 滁菊活性成分浸提工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 浸提時(shí)間的影響 稱(chēng)取7份2.00g干燥粉碎的菊花置于7個(gè)燒杯中，加40mL水，50℃恒溫振蕩浸提，每20min取出一個(gè)燒杯，抽濾得濾液定容至100mL。按1.2.2.2方法測(cè)定得率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2 浸提溫度的影響 稱(chēng)取9份2.00g干燥粉碎的菊花置于9個(gè)燒杯中，加40mL水，分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃水浴中，恒溫振蕩浸提 1h，抽濾，濾液定容至50mL，按1.2.2.2方法測(cè)定提取率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 液固比的影響 稱(chēng)取5份2.00g干燥粉碎的菊花置于5 個(gè)燒杯中，依次加20、40、60、80、100mL 水，50℃恒溫振蕩浸提1h，抽濾得濾液定容至100mL。按1.2.2.2方法測(cè)定提取率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化浸提工藝 以滁菊總黃酮及總多酚含量為考察指標(biāo)，選擇浸提溫度、浸提時(shí)間和液固比作為考察的三個(gè)影響因素，在不考慮交互作用情況下進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1。

1.2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性研究 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定參照張麗的研究方法略有改進(jìn)［14］。1mL 0.2U/mL α-葡萄糖苷酶溶入磷酸鉀緩沖液(pH6.8)5mL，1mL 樣品溶液，37℃ 恒溫 15min，加入2.5mmol/L PNPG 0.2L，37℃恒溫反應(yīng) 15min，再加入0.2mol/L Na2CO3終止液 2mL，稀釋至 10mL測(cè)定405nm處的吸光度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Microsoft office Excel 2003軟件繪制表格和圖形，采用正交設(shè)計(jì)助手3.1進(jìn)行顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提時(shí)間對(duì)提取效果的影響

浸提時(shí)間對(duì)滁菊活性成分浸提效果的影響如圖1所示。隨浸提時(shí)間的增加黃酮類(lèi)物質(zhì)及多酚類(lèi)物質(zhì)的得率先增加后減少，60min時(shí)二者的得率相對(duì)較高。這可能是在浸提初始時(shí)細(xì)胞內(nèi)外存在溶質(zhì)濃度差，浸提一段時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)達(dá)到平衡;浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)溶質(zhì)分解導(dǎo)致浸提液中溶質(zhì)含量降低。所以后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)選定提取時(shí)間為60min。

圖1 浸提時(shí)間對(duì)滁菊活性成分得率的影響Fig.1 Effect of extract time on extraction rate of Chuju Chrysanthemum morifolium

2.2 浸提溫度對(duì)提取效果的影響

浸提溫度對(duì)滁菊活性成分浸提效果的影響如圖2所示。由圖2可知，隨浸提溫度的增加二者得率均逐漸增加，這主要是因?yàn)闇囟壬撸铀俜肿舆\(yùn)動(dòng)，能夠促使有效物質(zhì)的溶出。但70℃以上由于溫度較高黃酮類(lèi)物質(zhì)及多酚類(lèi)物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)，同時(shí)引起雜質(zhì)的溶出。所以，后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)選定60℃為浸提溫度。

2.3 液固比對(duì)提取效果的影響

液固比對(duì)滁菊活性成分得率的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著液固比的增加，總黃酮和總多酚的得率均增加;液固比在30∶1時(shí)總多酚的得率趨于穩(wěn)定、液固比達(dá)到40∶1時(shí)總黃酮的得率趨于穩(wěn)定。這可能是滁菊粉末一定的情況下，溶劑量的增加使得樣品顆粒周?chē)苜|(zhì)濃度降低，增大了細(xì)胞內(nèi)外兩側(cè)的濃度差，從而促進(jìn)滁菊有效成分的溶出［15］。所以40∶1為最優(yōu)液固比。

圖2 浸提溫度對(duì)滁菊活性成分得率的影響Fig.2 Effect of extract temperature on extraction rate of Chuju Chrysanthemum morifolium

圖3 液固比對(duì)滁菊活性成分得率的影響Fig.3 Effect of the ratio of liquid to solid on extraction rate of Chuju Chrysanthemum morifolium

2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化浸提工藝

以滁菊總黃酮及總多酚含量為考察指標(biāo)，以浸提溫度、浸提時(shí)間和液固比作為變量，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［10］，因素水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析表Table 2 Result of orthogonal experiments and extreme difference analysis

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表2所示，在低溫浸提滁菊總多酚及總黃酮的影響因素中，影響大小為 A ＞B＞C，最優(yōu)水平為 A3、B2、C3。方差分析結(jié)果如表3、表4所示，三個(gè)影響因素中，溫度的影響顯著，其他兩個(gè)因素不顯著?？紤]到液固比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著和液固比增大使?jié)饪s成本增加，采用A3B2C1工藝，即用60℃按30∶1的液固比浸提50min為最佳工藝，在此條件下總多酚得率最高可達(dá)到5.905mg/g、總黃酮得率可達(dá)到53.138mg/g。

2.5 滁菊浸提液對(duì)α－葡萄糖苷酶活性的抑制作用

滁菊浸提液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用如圖4所示。由圖4可以看出，滁菊浸提液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有很強(qiáng)的抑制作用，并且隨著滁菊浸提液濃度增加，抑制作用增加。當(dāng)滁菊浸提液濃度為10μg/mL時(shí)，對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制率為8.5%，100μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到97.3%。滁菊浸提液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的IC50為32μg/mL。

表3 總多酚正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Results of variance analysis of total polyphenol

表4 總黃酮正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Results of variance analysis of total flavonoids

圖4 滁菊浸提液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory activities of Chuju Chrysanthemum morifolium extract against α-glucosidase

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，得出影響低溫浸提滁菊效果的因素依次為浸提溫度＞浸提時(shí)間＞液固比，從成本角度考慮，最優(yōu)浸提工藝為浸提時(shí)間50min、浸提溫度60℃、液固比為30∶1。在此工藝條件下，總多酚及總黃酮最高得率分別為 5.905、53.138mg/g。滁菊浸提液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的IC50為32μg/mL。本研究為滁菊飲料開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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