氧化對脂質(zhì)體膜性質(zhì)的影響

耿亞男，曹 棟，聶新艷，楊貝貝

(江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

脂質(zhì)體是一類由脂質(zhì)發(fā)生自我凝聚時產(chǎn)生的微囊體。近些年來，脂質(zhì)體在食品、化妝品、醫(yī)藥中都有廣泛應用［1］，如抗癌藥物的靶向給藥，包埋激素類肽、抗生素、維生素、酶等，脂質(zhì)體已經(jīng)成為一種理想的藥物傳遞載體。脂質(zhì)體的主要膜材為磷脂，磷脂是一種常見的有機兩性分子，由于其脂肪酸不飽和程度較高，極易發(fā)生氧化。在實際生產(chǎn)過程中，脂質(zhì)體的放大性生產(chǎn)及其保存是阻礙其應用的最大難題。影響脂質(zhì)體保存的主要原因是其具有易氧化、變形、分解等不穩(wěn)定的缺點，其中，磷脂的氧化是影響脂質(zhì)體品質(zhì)的最大因素。氧化后的磷脂必然導致膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，會影響雙層膜的流動性，使其發(fā)生相分離［2－3］，并使囊泡內(nèi)部無序化，形成孔洞［4－5］，從而破壞脂質(zhì)體。究其氧化原因，主要是由于活性氧攻擊脂質(zhì)體膜，氧化后的磷脂雙鍵被破壞而形成各種不同的小分子［6］。目前，磷脂氧化對脂質(zhì)體膜的影響機制還不明朗，本實驗通過Fenton反應控制脂質(zhì)體氧化，并通過脂質(zhì)體的粒徑、Zeta電位、脂質(zhì)體膜的微極性、流動性及形態(tài)等，研究了氧化對脂質(zhì)體膜的破壞作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆磷脂酰膽堿 SPC90，江蘇曼氏生物科技有限公司;1，6－二苯基－1，3，5－己三烯 DPH Sigma公司;鈣黃綠素 上海邁坤化工有限公司;Sephadex G－25 北京瑞達恒輝科技發(fā)展公司;氯仿、甲醇、氯化亞鐵、過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、濃鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司;所用試劑均為分析純。

UV－260紫外分光光度計 日本島津;納米粒度及ZETA電位儀 英國馬爾文公司;F－7000熒光光譜儀;H－7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;Hettich EBA20小型離心機 萊比信科技發(fā)展有限公司;電子精密天平 上海梅特勒－托利多儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 南京予凱儀器設備有限公司;超聲波發(fā)生器 無錫科潔超聲電子設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂質(zhì)體制備 取0.02g大豆卵磷脂置于小燒杯中，加入3mL氯仿/甲醇(2/1，V/V)混合液，放入1.0g左右玻璃珠，晃動溶解。將混合液轉(zhuǎn)移到500mL燒瓶中，于45℃、40r/min水浴蒸發(fā)氯仿/甲醇混合有機溶劑。在瓶內(nèi)壁形成一層薄膜，持續(xù)真空旋蒸1h以除去殘余溶劑，結(jié)束后沖入保護氣體氮氣。加入5mL磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH7.4)水化脂質(zhì)薄膜，形成5mL粗脂質(zhì)乳狀液。暗處用磁力攪拌器攪拌10min，所得粗脂質(zhì)體超聲(200W)處理10min，使用0.22μm濾膜過濾兩次整粒，暗處放置1h進行下步操作。

1.2.2 MDA值的測定 磷脂氧化后產(chǎn)物MDA的測量根據(jù)文獻［7］并稍有修改。TBA溶液配制:TCA 30g，TBA 0.75g，0.25mol/L 鹽酸 200mL，溫熱溶解，過濾后得TCA－TBA－HCl溶液。量取脂質(zhì)體乳狀液1.0mL于10mL帶刻度試管中，加入TCA－TBA－HCl混合溶液5mL，混勻，于100℃水浴30min，立刻冷卻。使用 TCA－TBA－HCl溶液定容至10mL，5000r/min離心 10min，以 TCA－TBA－HCl溶液為空白，測定532nm處溶液的吸光值(MDA的摩爾吸光率為1.56×105L/mol·cm)。剛制備好的脂質(zhì)體即用TBA的方法測量其在制備過程中的氧化程度。

1.2.3 透射電鏡觀察脂質(zhì)體形態(tài) 參照Mohsen M等［8］磷鎢酸－負染色法預處理脂質(zhì)體乳狀液，將體系中磷脂酰膽堿的濃度稀釋至為10mg/mL，先用潔凈干燥的注射器吸取剛制備好的脂質(zhì)體滴至附有支持膜的銅網(wǎng)上，樣品在Formvar膜上吸附約10min后，用濾紙小心吸除多余液體，再向膜上滴加2%磷鎢酸，染色5min左右，濾紙吸去染液，用燈烘干。在Hitachi透射電鏡(H－7650)下觀測并調(diào)整適合放大倍數(shù)進行拍照。

1.2.4 脂質(zhì)體膜的微極性測定 制備10－4mol/mL的芘的甲醇溶液，取0.5mL芘溶液于三角瓶中，氮氣吹干，加入40mL所制備的粗脂質(zhì)體乳狀液，控制溫度40℃超聲(200W)1h，測量芘的第一發(fā)射峰與第三發(fā)射峰強度比值I1/I3(在372nm處熒光強度與在384nm處的比值)以表征脂質(zhì)體膜的微極性。

1.2.5 脂質(zhì)體包封率測定 將適量鈣黃綠素溶于磷酸鹽緩沖液中，用上述緩沖液制備脂質(zhì)體。取1mL脂質(zhì)體樣品，置于用PBS平衡過的sephadex G－25柱上端，以PBS為洗脫液，于206nm處監(jiān)測脂質(zhì)體流出時間，使用熒光分光光度計測量熒光強度(EM 490nm，EX 520nm)，收集脂質(zhì)體。將流出的脂質(zhì)體溶液置于25mL容量瓶中，PBS加至刻度，混勻。測定分離前后脂質(zhì)體的熒光強度(F)，分別計算兩種脂質(zhì)體的包封率，按公式(1)計算。

式中，E(%)包封率;K－樣品的稀釋倍數(shù)比，本實驗為K取25;FL－所分離脂質(zhì)體的熒光值;FT－原脂質(zhì)體總熒光強度［9］。

1.2.6 脂質(zhì)體的膜流動性測定 使用1，6－二苯基－1，3，5－己三烯(DPH)對囊泡雙層流動性進行評估，測定雙層膜的熒光偏振率。DPH儲備液添加至脂質(zhì)體溶液中，達到最終磷脂與DPH濃度(molar)比為500∶1?；旌弦哼M行超聲(200W)并且45℃水浴保持1h。使用熒光光譜儀(F－7000)測量熒光光譜，設定發(fā)射光波長為426nm，激發(fā)光波長為348nm，發(fā)射光狹縫寬度10nm，激發(fā)光狹縫寬度為5nm。熒光偏振率按式(2)、式(3)計算。

式中，對公式中的字母含義做解釋;計算出相對偏振度Pn/P0［10］，P0為所測偏振度幾個之中的最小值(即氧化24h時所測值)，Pn為除最小值之外的其他值。計算的偏振率越大，膜的流動性越小，兩者成反比。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂質(zhì)體MDA值的變化

圖1為未添加Fenton試劑和添加Fenton試劑后24h內(nèi)脂質(zhì)體MDA值的變化。

圖1 Fenton試劑對脂質(zhì)體氧化的影響Fig.1 Influence of oxidation on MDA of liposomes

分析圖1可知，與未添加Fenton試劑的脂質(zhì)體相比，添加Fenton試劑后脂質(zhì)體的氧化程度明顯增加，并且在24h內(nèi)，氧化已經(jīng)達到一定程度。因此，可以確定添加Fenton試劑能夠迅速引發(fā)脂質(zhì)體氧化，并且通過重復實驗可知，脂質(zhì)體的氧化程度可以通過控制其反應時間來控制。

2.2 脂質(zhì)體粒徑及Zeta電位的變化

脂質(zhì)體溶液適度稀釋后測量其粒徑。用納米粒度及Zeta電位儀測其粒徑分布，結(jié)果見表1和圖2。

表1 脂質(zhì)體氧化后粒徑及Zeta電位的變化Table1 The influence of oxidation on particle size and Zeta potential

由圖2可以看出，在未加入Fenton試劑時，脂質(zhì)體粒徑分布為正態(tài)分布，且分布比較集中。添加Fenton試劑的脂質(zhì)體與未添加Fenton試劑的脂質(zhì)體相比，在24h后，脂質(zhì)體的粒徑略微變大，PDI指數(shù)也有所增加，這可能是脂質(zhì)體氧化后膜之間發(fā)生融合而造成的。未添加Fenton試劑的脂質(zhì)體粒徑與其24h前相比，粒徑稍有減小，這是剛制備好的脂質(zhì)體在抽濾整粒后多聚集在一起，隨后放置過程中發(fā)生少量分離的原因。表1結(jié)果顯示，脂質(zhì)體在氧化過程中，其粒徑變化趨勢為先增大再變小。氧化72h內(nèi)，脂質(zhì)體大小并發(fā)生較明顯變化，但96h時，脂質(zhì)體的粒徑及分布均發(fā)生劇烈改變，此時的脂質(zhì)體膜可能由于氧化發(fā)生崩解，脂質(zhì)體變成膜的碎片，導致平均粒徑變小，且大小不一。

圖2 脂質(zhì)體氧化后粒徑的變化Fig.2 The changes of liposome size after oxidation

脂質(zhì)體膜表面電荷對脂質(zhì)體的物理化學穩(wěn)定性也具有重要意義［11］，如改善脂質(zhì)體降解，及降低磷脂氧化率。添加Fenton試劑后用納米粒度及Zeta電位儀測脂質(zhì)體膜表面電位，由表1可以看出，F(xiàn)enton試劑加入后，Zeta電位的絕對值減小。一般來說，脂質(zhì)體膜電位絕對值越大，由于膜之間的斥力作用，體系越加穩(wěn)定。由文獻［12］可知，實驗原料中還有少量電負性磷脂，因此，Zeta電位的降低一方面可能是由于電負性磷脂氧化導致含量降低，另一方面可能是氧化所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物而造成的。另外，Zeta電位絕對值的降低使得體系更加不穩(wěn)定。

2.3 電鏡掃描脂質(zhì)體形態(tài)的變化

由圖3分析可知，所制備的脂質(zhì)體大小較為均勻，大小基本保持在110～130nm，與納米粒度儀所測結(jié)果是一致的。未氧化的脂質(zhì)體的形態(tài)相對較為規(guī)則，大小較集中，邊界較清晰，所制得脂質(zhì)體多為多室脂質(zhì)體;經(jīng)Fenton試劑氧化24h后，脂質(zhì)體形態(tài)上與前者出現(xiàn)較大不同，脂質(zhì)體的粒徑接近200nm，并且大小不均，形態(tài)不規(guī)則，脂質(zhì)體邊界不整齊，處于瓦解邊緣。脂質(zhì)體溶液中出現(xiàn)了脂質(zhì)體碎片，另外，原來的多室消失，出現(xiàn)了融合的現(xiàn)象。融合是導致脂質(zhì)體粒徑變大的最主要原因。在脂質(zhì)體氧化96h時，脂質(zhì)體已經(jīng)不是球形，脂質(zhì)體基本完全瓦解崩潰，溶液中出現(xiàn)的是大量的脂質(zhì)體膜碎片。

2.4 脂質(zhì)體膜的微極性的變化

計算各膠束體系的I1/I3，根據(jù)它隨時間的變化繪制得到圖4。

根據(jù)芘的熒光強度I1/I3值大小可以確定脂質(zhì)體膜體系的微極性。由于芘元素非極性大，其主要分布在磷脂分子的非極性尾中，即雙層膜之間。I1/I3值反映芘周圍環(huán)境的變化，比值越大，微極性越強，探針所處的環(huán)境非極性越弱;比值越小則微極性越弱，探針所處的環(huán)境非極性越強。由圖4可以看出，隨著氧化時間的增加，脂質(zhì)體膜的微極性大體上略有增加。這是由于磷脂在氧化過程中產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物主要是極性小分子，氧化后的磷脂極性增加的趨勢，與所預測的是一致的。

圖3 脂質(zhì)體氧化后其形態(tài)變化Fig.3 Microscopic image of liposome

圖4 脂質(zhì)體膜微極性的變化Fig.4 The influence of oxidation on liposome micropolaity

2.5 脂質(zhì)體包封率的變化

測定添加Fenton試劑前后所分離的脂質(zhì)體熒光強度的變化，進而得到包封率變化。

表2 脂質(zhì)體包封率的變化Table2 The influence of oxidation on liposomes encapsulation

包埋率可以驗證脂質(zhì)體膜的完整性，鈣黃綠素為水溶性物質(zhì)，因此，鈣黃綠素的包埋率越高，膜的結(jié)構(gòu)越致密，膜的完整性程度越高。實驗結(jié)果表明，脂質(zhì)體在添加Fenton試劑后，鈣黃綠素包封率降低了一倍。磷脂脂肪酸鏈氧化后發(fā)生斷裂或基團改變，引起了脂質(zhì)體膜的降解及融合，使鈣黃綠素從脂質(zhì)體中溶出，從而影響了膜的致密性。將包埋有鈣黃綠素的脂質(zhì)體溶液置于透析袋中，每20h檢測一次透析液鈣黃綠素熒光強度，結(jié)果如圖5所示，在加入Fenton試劑50h內(nèi)，鈣黃綠素的泄漏量持續(xù)增加;而50h后，透析液中的鈣黃綠素含量逐漸下降。實驗證實，在氧化初期，脂質(zhì)體膜發(fā)生破裂融合，鈣黃綠素在膜降解過程中釋放出來，在4d后，脂質(zhì)體在氧化的作用下基本上全體瓦解，鈣黃綠素完全釋放出來。

圖5 脂質(zhì)體泄漏率與其氧化時間之關(guān)系Fig.5 The relationship between liposome leakage rate and its oxidation time

2.6 脂質(zhì)體膜的流動性變化

由圖6可以看出，經(jīng)Fenton試劑氧化后，膜的相對流動性下降，膜的流動性主要是依靠脂肪酸的相對運動，氧化后脂肪酸鏈發(fā)生斷裂，降解是膜的流動性降低的主要原因。脂質(zhì)體在添加Fenton試劑后其膜流動性下降，可能是由于氧化后磷脂發(fā)生改性，磷脂脂肪酸鏈可活動自由度降低。

圖6 脂質(zhì)體膜流動性的變化Fig.6 The influence of oxidation on the liposomal membrane relative mobility

3 結(jié)論

本實驗通過一些較新的實驗手段對氧化后的脂質(zhì)體膜進行的分析。通過對照Fenton反應控制氧化前后脂質(zhì)體性質(zhì)的變化，包括MDA值、粒徑、Zeta、形態(tài)、膜微極性、包埋率和膜流動性，進而確定了氧化對脂質(zhì)體性質(zhì)的影響。隨著氧化的深入，脂質(zhì)體的粒徑分布更加不集中，由于多室脂質(zhì)體膜融合，其體積稍有變大，脂質(zhì)體的形態(tài)也不規(guī)則，最后脂質(zhì)體發(fā)生了降解，脂質(zhì)體溶液中出現(xiàn)了脂質(zhì)體碎片。由于氧化過程中產(chǎn)生的極性小分子，脂質(zhì)體膜的微極性大體上略有增加。氧化后脂質(zhì)體包埋率下降，在4d后脂質(zhì)體所包埋的鈣黃綠素基本上釋放完全。由于氧化后脂肪酸鏈發(fā)生斷裂，膜的相對流動性下降。

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