大孔樹脂純化藍(lán)莓總黃酮及其抗氧化活性研究

邵盈盈，李向榮

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310058;2.浙江大學(xué)城市學(xué)院，浙江杭州 310015)

藍(lán)莓，又稱越橘，屬杜鵑花科，越橘屬植物，為多年生落葉或常綠灌木，是地球上少有的真正的藍(lán)色食物之一［1］。果實(shí)富含花青素，綠原酸，黃酮等多種生物活性成分，而其中的黃酮類化合物在抗氧化、保護(hù)人體免受自由基的損傷，增強(qiáng)血管彈性，改善循環(huán)系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫力，延緩衰老，保護(hù)視力，改善弱視等方面起到一定的作用［2－4］。因此藍(lán)莓是理想的天然抗氧化產(chǎn)物的來源。大孔吸附樹脂是一種有機(jī)高聚物吸附劑，具有性質(zhì)穩(wěn)定、選擇性強(qiáng)、處理量大、再生方便等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物工業(yè)化提取分離中有廣泛的應(yīng)用［5］。目前對(duì)藍(lán)莓果渣、藍(lán)莓葉中花青素和黃酮的純化及其抗氧化活性研究較多［6］，而對(duì)藍(lán)莓果實(shí)中總黃酮的分離純化和抗氧化活性少見報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)4種樹脂進(jìn)行篩選，考察了各工藝對(duì)純化效果的影響，確定最優(yōu)純化條件，初步探討了藍(lán)莓總黃酮的抗氧化活性，為藍(lán)莓在食品、藥品領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100080－200707;藍(lán)莓 智利進(jìn)口，品種:藍(lán)豐藍(lán)莓;AB－8、NKA－9、NKA－Ⅱ、D101 型大孔吸附樹脂 南開大學(xué)化工廠;VC對(duì)照品 桐鄉(xiāng)市康普達(dá)生物科技有限公司，批號(hào):20110630;DPPH 美國(guó)Sigma公司;鄰二氮菲 天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn);其他試劑均為分析純。

Mettler Toledo AL104電子天平 梅特勒－托利多儀器上海有限公司;KQ－700DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE－2000B型 上海亞榮生化儀器廠;DKZ－1型電熱恒溫振蕩水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;粉碎機(jī)FW135 天津市泰斯特儀器有限公司;DHG－9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHB－ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵 河南省太康科教器材廠;HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;φ2cm×40cm層析柱 常青化工。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［7］

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品40.0mg，置于100mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，配成0.4mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分別吸取儲(chǔ)備液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2mL 至 10mL 刻度試管中，加 30%乙醇至5.4mL，搖勻，加5%NaNO2溶液0.3mL，搖勻靜置6min，加10%Al(NO3)3溶液0.3mL，搖勻靜置6min，加4%NaOH溶液4mL，搖勻靜置15min后在510nm處測(cè)定吸光度(以試劑空白做參比)，建立回歸方程為A=13.693C－0.0103(R2=0.9994)。

1.3 藍(lán)莓總黃酮的提取及含量測(cè)定

1.3.1 藍(lán)莓預(yù)處理 藍(lán)莓鮮果洗凈自然晾干后，放入干燥箱內(nèi)40℃下干燥1d，取出剪開后繼續(xù)干燥至恒重。將干燥藍(lán)莓粉碎成細(xì)顆粒狀，過24目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 藍(lán)莓總黃酮的提取 取預(yù)處理藍(lán)莓粉末50g，用20倍量50%乙醇于40℃超聲提取三次，每次45min，固定超聲功率560W，超聲提取后抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后備用。

1.3.3 樣品溶液黃酮含量的測(cè)定 取樣品溶液1mL，置于10mL刻度試管中，自“加30%乙醇至5.4mL”起，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品溶液的濃度及黃酮含量。

1.4 大孔樹脂純化藍(lán)莓總黃酮

1.4.1 大孔樹脂預(yù)處理 用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇浸泡24h，而后用95%乙醇洗至取出適量流出液加水混合不出現(xiàn)渾濁為止，在乙醇中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 樹脂靜態(tài)篩選 分別取一定體積(相當(dāng)于1g干樹脂)的四種樹脂置100mL具塞錐形瓶中，加提取液30mL，25℃水浴振蕩24h，使其達(dá)到飽和吸附，靜置2h過濾，吸取濾液測(cè)定總黃酮濃度。按式(1)計(jì)算樹脂飽和吸附量:

過濾出來的樹脂吸干表面水分，加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇30mL，25℃水浴振蕩6h，靜置2h過濾，測(cè)定濾液濃度，按式(2)計(jì)算洗脫率:

1.4.3 純化藍(lán)莓總黃酮單因素考察 上樣濃度對(duì)黃酮回收率的影響:將不同濃度的藍(lán)莓總黃酮提取液動(dòng)態(tài)上樣，用3BV的60%乙醇溶液(調(diào)pH3)洗脫，洗脫流速為2mL·min－1。洗脫液pH對(duì)黃酮回收率的影響:將一定濃度的藍(lán)莓總黃酮提取液動(dòng)態(tài)上樣，用3BV的pH分別為1、2、3、4、5的60%乙醇溶液洗脫，洗脫流速為2mL·min－1。洗脫液濃度對(duì)黃酮回收率的影響:將一定濃度的藍(lán)莓總黃酮提取液動(dòng)態(tài)上樣，用3BV濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%的固定 pH3的乙醇溶液洗脫，洗脫流速為2mL·min－1。洗脫流速對(duì)黃酮回收率的影響:將一定濃度的藍(lán)莓總黃酮提取液動(dòng)態(tài)上樣，用3BV的60%乙醇溶液(調(diào)pH3)洗脫，洗脫流速分別控制在0.5、1、2、3、4mL·min－1。四個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)中上樣流速均固定為2mL·min－1，上樣完成后靜置1h，洗脫前用3BV純化水對(duì)樹脂柱進(jìn)行沖洗，洗脫過程中收集洗脫液，計(jì)算回收率。

1.4.4 純化藍(lán)莓總黃酮的正交實(shí)驗(yàn) 以25mL床層體積(BV)的樹脂裝柱，用大量蒸餾水沖洗樹脂至流出液無醇味為止。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定因素水平表，按各正交實(shí)驗(yàn)號(hào)下條件進(jìn)行上樣，見表1，上樣流速固定2mL·min－1，上樣完成后靜置1h使黃酮類成分能夠大量吸附，洗脫前用3BV純化水對(duì)樹脂柱進(jìn)行沖洗，然后用3BV的相應(yīng)洗脫液洗脫，收集洗脫液，計(jì)算回收率。

表1 因素水平表Table1 Factors and levels

1.4.5 藍(lán)莓總黃酮純度的測(cè)定 按最佳條件純化后的藍(lán)莓總黃酮洗脫液55℃真空干燥后稱重、測(cè)定其中總黃酮的含量，計(jì)算純度。

1.5 藍(lán)莓總黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.5.1 對(duì) DPPH自由基的清除能力［7］精密稱取19.716mg DPPH，用無水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，得C=0.2mmol·L－1的溶液。將純化后的藍(lán)莓總黃酮、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和VC分別用無水乙醇配置成各個(gè)濃度，在10mL比色管中加入待測(cè)樣液2mL，DPPH·溶液2mL，混勻，避光靜置30min，在517nm處測(cè)定吸光度A樣品，以2mL無水乙醇代替待測(cè)液，得到吸光度A空白，以2mL無水乙醇代替DPPH·溶液，得到吸光度A對(duì)照。每一吸光度平行測(cè)定三次，取平均值。清除率按式(3)計(jì)算:

1.5.2 對(duì)羥基自由基(·OH)的清除能力［8］在比色管中加入1.5mmol·L－1鄰二氮菲的無水乙醇溶液1mL，PBS 溶液 2mL 和 1.5mmol·L－1FeSO4溶液1mL，混勻后，再加入各濃度樣液1mL和0.1%H2O2溶液1mL，充分混勻后，37℃水浴60min，在536nm處測(cè)定樣品吸光度A樣品。以蒸餾水2mL代替樣液和H2O2溶液所測(cè)吸光度為空白吸光度A空白，以蒸餾水1mL代替樣液所測(cè)吸光度為損傷吸光度A損傷。清除率按式(4)計(jì)算:

2 結(jié)果與分析

2.1 四種樹脂的靜態(tài)吸附與解析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，NKA－Ⅱ型樹脂的飽和吸附量最高，NKA－9和AB－8型次之，D101型樹脂的吸附量最小，從解析率來看，也是NKA－Ⅱ型樹脂最容易解析，其次分別是 NKA－9、D101、AB－8。因此選擇NKA－Ⅱ型樹脂作為純化藍(lán)莓總黃酮的樹脂。

表2 四種樹脂的靜態(tài)吸附－解析結(jié)果Table2 Static adsorption capacity and elution ratio result of four types of macroporous resins

2.2 單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分析表3～表6可知，隨著上樣液濃度的增大，黃酮回收率增加，當(dāng)濃度為1.355mg·mL－1時(shí)，回收率達(dá)到最大，之后濃度增加，黃酮回收率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)洗脫液pH為3時(shí)總黃酮的回收率最高。乙醇濃度較低時(shí)，回收率隨著濃度上升而增加，到達(dá)60%時(shí)最高，隨后略有下降。流速較慢時(shí)，回收率變化不大，增加流速，回收率逐漸降低。

表3 上樣濃度對(duì)黃酮回收率的影響Table3 Effect of concentration of liquid sample on recovery yield of total flavonoids

表4 洗脫液pH對(duì)黃酮回收率的影響Table4 Effect of eluent’s pH on recovery yield of total flavonoids

表5 洗脫液濃度對(duì)黃酮回收率的影響Table5 Effect of concentration of ethanol on recovery yield of total flavonoids

表6 洗脫流速對(duì)黃酮回收率的影響Table6 Effect of elution velocity on recovery yield of total flavonoids

2.3 NKA－Ⅱ型樹脂純化藍(lán)莓總黃酮正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分析表7可得:B為主要因素，C和A次之，D最小，最佳工藝條件為A2B2C3D2，因此確定純化藍(lán)莓總黃酮的最佳工藝條件為上樣濃度1.355 mg·mL－1，洗脫 pH為 3，洗脫乙醇濃度 70%，洗脫流速2mL·min－1。在該條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次，回收率為96.83%，均高于正交實(shí)驗(yàn)時(shí)的回收率。將最佳工藝條件下純化后的洗脫液真空干燥，計(jì)算純度得41.41%，比未純化前提高33.94倍。

2.4 藍(lán)莓總黃酮抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH·是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm處有一強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，其供氫或供質(zhì)子特性，可以與DPPH·的單電子配對(duì)，使自由基濃度降低，紫色減弱。褪色程度與DPPH·接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，反應(yīng)快速、靈敏、簡(jiǎn)便，因此可用于評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的自由基清除活性。由表8可知，蘆丁、藍(lán)莓總黃酮和VC對(duì)DPPH·的清除能力表現(xiàn)為隨著濃度的升高，清除率迅速上升，而且基本呈線性關(guān)系，藍(lán)莓總黃酮和蘆丁的清除能力相當(dāng)，但弱于VC。

表8 藍(lán)莓總黃酮、蘆丁和VC對(duì)DPPH·清除能力Table8 Scavenging activity of flavonoids from blueberry lutin and VCon DPPH·

2.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力 Fe2+與H2O2反應(yīng)生成·OH，F(xiàn)e2+與鄰二氮菲反應(yīng)生成紅色配合物，·OH能氧化Fe2+成為Fe3+而使紅色配合物減少，當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，抗氧化劑與·OH作用減弱了·OH對(duì)Fe2+的氧化，而使吸光度有所變化，因此常用來檢測(cè)天然化合物的抗氧化活性。蘆丁、藍(lán)莓總黃酮和VC對(duì)·OH的清除率也是隨著濃度的升高而迅速上升，基本呈線性關(guān)系，藍(lán)莓總黃酮清除·OH的能力最強(qiáng)，高于蘆丁和VC，見表9，因此可知藍(lán)莓總黃酮具有較好的清除·OH的能力。

表9 藍(lán)莓總黃酮、蘆丁和VC對(duì)·OH清除能力Table9 Scavenging activity of flavonoids from blueberry lutin and VCon·OH

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)四種樹脂進(jìn)行篩選，得出NKA－Ⅱ型樹脂對(duì)藍(lán)莓總黃酮有較好的吸附和解吸性能，富集效果好，因此選用NKA－Ⅱ樹脂進(jìn)行純化正交實(shí)驗(yàn)。最佳純化工藝為:上樣濃度1.355 mg·mL－1，洗脫pH為 3，洗脫乙醇濃度 70%，洗脫流速2mL·min－1。其中洗脫液pH對(duì)純化的影響最大，在pH為3時(shí)的效果最好，因?yàn)辄S酮類物質(zhì)為多羥基化合物，呈現(xiàn)一定的酸性，所以在微酸性條件下容易被樹脂吸附，而且藍(lán)莓總黃酮中花青苷類所占比例較大，花青苷類物質(zhì)在pH等于3時(shí)最穩(wěn)定。大孔樹脂純化有效成分是利用其對(duì)有效成分吸附－解析的可逆性，因此洗脫劑濃度亦是純化過程中的重要影響因素，本實(shí)驗(yàn)得出洗脫劑乙醇的濃度為70%時(shí)純化效果較好，與50%和60%的乙醇相比，更易將藍(lán)莓總黃酮從大孔樹脂上解析下來。

實(shí)驗(yàn)中，上樣時(shí)采用的流速是2mL·min－1，因?yàn)榇罂孜綐渲闹鶎游鍪且环N動(dòng)態(tài)吸附過程，溶液上樣流速的變化直接影響黃酮分子向樹脂內(nèi)表面的擴(kuò)散，從而影響吸附效率，流速過快，樹脂對(duì)總黃酮吸附不充分，易造成浪費(fèi)，但流速過慢，將導(dǎo)致整個(gè)生產(chǎn)周期的延長(zhǎng)。上樣完成后靜置1h使黃酮類成分能夠充分吸附，在洗脫前，用3BV的純化水先對(duì)樹脂柱進(jìn)行沖洗，以除去大部分糖類和氨基酸等雜質(zhì)，保證醇洗脫時(shí)流出液具有最大的純度。藍(lán)莓總黃酮提取液經(jīng)大孔吸附樹脂處理后純度增加，雜質(zhì)大幅度降低，同時(shí)樹脂處理可有效地除去提取液中的糖類、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)等。此純化方法操作簡(jiǎn)便，回收率高，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)有一定的參考意義。

本文還采用DPPH法和鄰二氮菲法評(píng)價(jià)了藍(lán)莓總黃酮的抗氧化活性，通過對(duì)藍(lán)莓總黃酮、蘆丁和VC的對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，藍(lán)莓總黃酮可有效清除DPPH·和·OH，其中對(duì)·OH的清除能力優(yōu)于天然抗氧化劑VC，推測(cè)黃酮類化合物中的多元酚羥基是其具有抗氧化活性的主要藥效基團(tuán)?？傊?，藍(lán)莓中的黃酮類化合物是一種良好的自由基清除劑，可作為一種新的提取天然食品抗氧化劑的水果加以開發(fā)利用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

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