牛玻璃酸酶酶學(xué)特性的研究

楊萌萌，韓 玲，*，李儒仁，余群力，左秀峰，韓廣星，郭兆斌

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.山東綠潤食品有限公司，山東臨沂276000）

牛玻璃酸酶（Hyaluronidase），是從牛睪丸中提取的一類水解酶，是我國生化制藥行業(yè)的重要產(chǎn)品之一。牛玻璃酸酶能夠水解透明質(zhì)酸，用于人體能暫時降低細(xì)胞間質(zhì)粘性，可促使皮下輸液、局部積貯的滲出液或血液加快擴(kuò)散而利于吸收，是一種重要的藥物擴(kuò)散劑。臨床用作藥物滲透劑，促進(jìn)藥物吸收，促進(jìn)手術(shù)及創(chuàng)傷后局部水腫或血腫消散。玻璃酸酶不但在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，而且在保健品、食品添加劑領(lǐng)域也有卓越的貢獻(xiàn)。人為補(bǔ)充玻璃酸酶保健品可消除皺紋或使局部器官增厚增高，使皮膚保持彈性。

目前，對玻璃酸酶的研究主要針對哺乳動物睪丸、蝎毒、蜂毒、蛇毒等，并且已經(jīng)從牛睪丸[1]、蝦胰腺[2]以及蝎毒[3-4]、蜂毒[5]、蛇毒[6-8]、魚毒[9]、毛蟲毒[10]中分離出了玻璃酸酶。但是，國內(nèi)對于玻璃酸酶的研究主要是粗酶液的制備和粗酶液性質(zhì)的研究，并且，針對同一原料，對其粗酶液的性質(zhì)研究出現(xiàn)了不同的結(jié)果，由于粗酶液中存在大量雜蛋白，雜蛋白對酶的穩(wěn)定性以及酶學(xué)性質(zhì)的研究有很大影響。因此，實驗以色譜層析純化后的牛玻璃酸酶為原料，對牛玻璃酸酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為玻璃酸酶的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛睪丸 采自山東綠潤食品有限公司，選取檢疫合格的牛睪丸，清除表面異物，用聚乙烯塑料包裝袋密封包裝，液氮凍藏后于-80℃貯藏，備用；透明質(zhì)酸鈉、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、乙酸、乙酸鈉、NaCl、硫酸銨、丙烯酰胺、N-N-甲叉雙丙稀酰胺、甘氨酸、Tris、甘油、考馬斯亮藍(lán)、甲醇、冰醋酸 分析純；SP Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-100（GE）。

DS-1型組織搗碎機(jī) 金壇市金南儀器廠；PHS-3C型pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠；AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器公司；SP-756P型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DYY-6c型電泳儀電源、25D型電泳槽 北京市六一儀器廠；DPS-2型蛋白純化系統(tǒng) 上海金達(dá)生化儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛玻璃酸酶粗酶液的提取 牛睪丸去外膜后，切成塊狀，加入提前預(yù)冷的提取劑（w/v=1∶2），勻漿3min，4℃冰箱中靜置提取12h，離心（8000r/min，4℃，20min），棄去沉淀，得到牛玻璃酸酶提取液；在提取液中加入飽和硫酸銨溶液使硫酸銨的濃度達(dá)到35%，混勻靜置4h，離心（8000r/min，4℃，20min），得上清液；上清液中加入飽和硫酸銨溶液使其濃度達(dá)到70%，混勻靜置8h，離心（8000r/min，4℃，20min）得沉淀，在4℃蒸餾水中透析，透析后得到牛玻璃酸酶粗酶液[11]。

1.2.2 牛玻璃酸酶的純化 將粗酶液加載到離子交換預(yù)裝柱（SP Sepharose Fast Flow），平衡緩沖液為50mmol/L乙酸-乙酸鈉（pH5.4），洗脫緩沖液為50mmol/L乙酸-乙酸鈉（pH5.4，包含1mol/L NaCl），流速為5mL/min。收集有活性的部分用于凝膠過濾層析（Sephacryl S-100）純化，平衡緩沖液與洗脫緩沖液為50mmol/L乙酸-乙酸鈉（pH5.4，包含0.15mol/L NaCl），流速為0.5mL/min。收集有活性的部分用于SDS-PAGE和酶學(xué)性質(zhì)的研究[12-14]。

1.2.3 牛玻璃酸酶酶活的測定 參照Mayumi[15]的方法并予以改進(jìn)。0.2mL酶液與0.8mL透明質(zhì)酸鈉儲備液，混合后37℃下保溫15min，同時做空白實驗。孵化結(jié)束后立即加入0.22mL四硼酸鉀沸水浴4.5min，迅速冷卻4min；加6mL稀釋至10倍體積的DMAB顯色劑，然后37℃保溫20min，迅速冷卻5min。顯色反應(yīng)結(jié)束后，10000r/min，4℃離心10min，585nm下測吸光度值。一個酶活單位（U）被定義為，在最適反應(yīng)溫度（37℃）條件下，玻璃酸酶分解透明質(zhì)酸鈉，每分鐘釋放1μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖的量。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[16]。

1.2.5 SDS-PAGE 經(jīng)過色譜層析純化的樣品用于SDS-PAGE，聚丙烯酰胺凝膠濃度為12%，Tris-glycine（pH8.8）作為電泳緩沖液，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1h。

1.2.6 牛玻璃酸酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.6.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 在pH4.5的條件下，以透明質(zhì)酸鈉為底物，分別測定玻璃酸酶在4、15、24（室溫）、37、45、50、55、60、70℃條件下的酶活力。此外，將玻璃酸酶在上述溫度下分別預(yù)處理60min，觀察其熱穩(wěn)定性[17]。

1.2.6.2 pH對牛玻璃酸酶活性的影響 用0.2mol/L乙酸鈉溶液和0.2mol/L乙酸溶液配成pH2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（0.1mol/L）。以透明質(zhì)酸鈉為底物，測定牛玻璃酸酶在2.5～7.5不同pH條件下的酶活。

1.2.6.3 NaCl濃度對牛玻璃酸酶活性的影響 用0.2mol/L乙酸鈉溶液和0.2mol/L乙酸溶液配成pH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（0.1mol/L），其中NaCl濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mol/L。用上述含不同NaCl濃度的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制底物透明質(zhì)酸鈉，測定酶活，考察NaCl濃度對酶活的影響。

1.2.6.4 BSA濃度對牛玻璃酸酶活性的影響 用0.2mol/L乙酸鈉溶液和0.2mol/L乙酸溶液配成pH為4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（0.1mol/L），其中BSA濃度 分別為 0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9、1.05mol/L。用上述含不同BSA濃度的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制底物透明質(zhì)酸鈉，測定酶活，觀察BSA濃度對酶活的影響。

1.2.6.5 金屬離子對牛玻璃酸酶活性的影響 玻璃酸酶中分別加入Fe3+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、K+，使各離子溶液在酶液中的終濃度為0.8mmol/L，室溫下反應(yīng)60min后檢測酶活變化。空白不加任何離子，考察酶活變化情況[18]。

1.2.6.6 不同物質(zhì)濃度對牛玻璃酸酶活性的影響 在0.1mol/L的乙酸乙酸鈉緩沖液（pH4.5）中，玻璃酸酶分別與不同濃度的肝素、硫酸軟骨素（A、B、C）、人類血清蛋白及半胱氨酸混合均勻，4℃下反應(yīng)30min后測其酶活。反應(yīng)條件一致的情況下，對照不加抑制劑和激活劑，觀察酶活變化情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE

由圖1可知，陽離子交換層析之后（IEX），雜蛋白較多；粗酶液經(jīng)過陽離子交換層析和凝膠過濾（GF）層析兩步純化后，1號泳道出現(xiàn)兩個濃度較高的條帶，其分子量在55～72ku之間。這一結(jié)果與Malcolm Lyon[1]的研究結(jié)果一致，這兩條帶顯示的酶屬于同工酶，均屬于糖蛋白。

圖1 牛玻璃酸酶SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of hyaluronidase from bovine testicular

2.2 溫度對牛玻璃酸酶活性的影響

由圖2可知，在4～70℃范圍內(nèi)，牛玻璃酸酶的酶活隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，37℃時達(dá)到最大值，這與Yang[19]的結(jié)果一致。60、70℃的酶活分別為最高酶活的14.84%和4.31%。不同溫度下預(yù)處理1h之后，溫度從4℃升高至37℃的過程中，酶活穩(wěn)定；從37℃升高至60℃過程中，牛玻璃酸酶很不穩(wěn)定，并且酶活損失嚴(yán)重，在60℃下酶活完全喪失。

圖2 牛玻璃酸酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig.2 Optimal temperature and thermal stability of hyaluronidase from bovine testicular

2.3 pH對牛玻璃酸酶活性的影響

酸性環(huán)境對牛玻璃酸酶維持活性是必不可少的條件，如圖3所示，不同pH的0.1mol/L乙酸乙酸鈉溶液對玻璃酸酶酶活的影響不同，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。高酸性抑制酶活，pH為2.5時，酶活趨近于零；堿性環(huán)境對酶起抑制作用；pH為4.5時，酶活最高。

圖3 牛玻璃酸酶的最適pHFig.3 Optimal pH of hyaluronidase from bovine testicular

2.4 NaCl濃度對牛玻璃酸酶活性的影響

圖4 NaCl濃度對牛玻璃酸酶活性的影響Fig.4 Effect of NaCl on the activity of hyaluronidase from bovine testicular

由圖4可知，不同濃度的NaCl對玻璃酸酶酶活的影響各不相同。以不添加NaCl的為基準(zhǔn)，濃度在0.05～0.45mol/L的范圍內(nèi)提高酶活，超過0.45mol/L時抑制酶活，0.2mol/L時酶活最高，比不添加NaCl的高出了20U/mg。

2.5 BSA濃度對牛玻璃酸酶活性的影響

由圖5可知，以不加BSA為基準(zhǔn)，濃度在0～0.75mol/L的范圍內(nèi)增加酶活，0.45mol/L時酶活最高，增加了34%。當(dāng)BSA濃度超過0.75mol/L時，BSA開始抑制酶活，1.05mol/L時損失了33%的酶活。

圖5 BSA濃度對牛玻璃酸酶活性的影響Fig.5 Effect of BSA on the activity of hyaluronidase from bovine testicular

2.6 金屬離子對牛玻璃酸酶活性的影響

由圖6可知，以不加金屬離子為基準(zhǔn)，七種離子對牛睪丸玻璃酸酶均有不同程度的抑制作用，酶活損失較多。其中Fe3+對該酶的抑制作用相對其他離子較強(qiáng)，Mg2+的抑制作用相對較弱。金屬離子可以對玻璃酸酶產(chǎn)生抑制作用，可能是因為其阻礙了酶和底物的結(jié)合作用，從而抑制了該酶的酶活。

圖6 金屬離子對牛玻璃酸酶活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on the activity of hyaluronidase from bovine testicular

2.7 不同物質(zhì)濃度對牛玻璃酸酶活性的影響

由圖7可知，不同物質(zhì)的濃度對玻璃酸酶酶活的影響各不相同。硫酸軟骨素A的濃度為1.2mg/mL時，損失了31.08%的酶活，隨著濃度的下降，酶活損失的就越少，當(dāng)濃度為0.012mg/mL時，酶活基本上沒有損失。不同濃度的硫酸軟骨素B對酶活的影響不大，1.2、0.12mg/mL時分別損失了7.23%和5.07%，0.012mg/mL增加了1.36%的酶活。硫酸軟骨素C對酶活的影響顯著，1.2mg/mL時損失了45.07%的酶活，低濃度時酶活基本沒有損失。肝素對酶活起著較小的抑制作用，損失在10%之內(nèi)。低濃度的人類血清蛋白可增加1.05%的酶活。半胱氨酸使酶完全失活。

圖7 不同物質(zhì)濃度對牛玻璃酸酶活性的影響Fig.7 Effect of different material on the activity of hyaluronidase from bovine testicular

3 結(jié)論

3.1 牛玻璃酸酶水解透明質(zhì)酸鈉的最適pH和溫度分別為4.5和37℃，在4～45℃條件下穩(wěn)定性較好。NaCl和BSA濃度分別為0.2、0.45mol/L時酶活最高。

3.2 金屬離子Mg2+對該酶的抑制作用較弱，F(xiàn)e3+的抑制作用較強(qiáng)。硫酸軟骨素A濃度為1.2mg/mL時對酶有抑制作用，低濃度0.012mg/mL時對酶基本沒有影響。硫酸軟骨素B對酶的抑制作用較小，濃度0.012mgm/L時可增加少許酶活。硫酸軟骨素C濃度為1.2mg/mL時，對酶的抑制作用較強(qiáng)。肝素在濃度低時抑制作用較高。人類血清蛋白在低濃度時增加1.05%的酶活。半胱氨酸使酶失活。

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