海參皂苷對(duì)自發(fā)性糖尿病小鼠的降血糖作用

溫 敏，王佳慧，劉豐海，王玉明，薛長(zhǎng)湖，薛 勇，*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.青島市市立醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島266003）

糖尿病是一種糖代謝紊亂疾病，可分為Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，后者在糖尿病患者中約占90%，主要表現(xiàn)為高血糖、高胰島素血癥及胰島素抵抗。因此，控制血糖是預(yù)防和治療糖尿病的有效方法[1]。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制α-糖苷酶的活性以延緩葡萄糖的吸收是控制餐后血糖升高的有效途徑[2]。目前，市售的阿卡波糖、伏格列波糖等α-糖苷酶抑制劑類藥物已經(jīng)在臨床得到廣泛利用，但是它們存在著一些副作用，如腹瀉、腹脹、脹氣和輕度皮疹等[3]。已有較多的研究表明，食物中也存在著能夠抑制α-糖苷酶活性的功效成分。對(duì)于存在糖耐異常，但未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的人群來說，通過攝取食品功效成分抑制餐后血糖的升高是預(yù)防糖尿病的有效方法。海參，是我國傳統(tǒng)的保健食品，研究者發(fā)現(xiàn)其含有多種生物活性物質(zhì)。海參皂苷是海參體內(nèi)所特有的一類三萜皂苷，在海參的體壁、內(nèi)臟和腺體等組織中均有分布。目前關(guān)于海參皂苷抗腫瘤[4]、抑菌[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]和減肥[7]等方面的研究多有報(bào)道。但鮮有海參皂苷對(duì)于糖代謝影響的研究。本研究分別從海參皂苷對(duì)α-糖苷酶及淀粉酶的體外抑制活性和對(duì)糖尿病小鼠糖代謝的影響兩方面進(jìn)行探討，進(jìn)一步為海參皂苷的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57BL/KsJ（db/db）小鼠共計(jì)12只 SPF級(jí)，雄性，體重20～25g；C57BL/KsJ小鼠 5只，SPF級(jí)，雄性，體重18～22g，購自南京青紫蘭；雄性Wistar大鼠 4只，SPF級(jí)，100～120g，購自青島藥檢所；酵母α-1，4-糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、豬胰α-淀粉酶 美國Sigma公司；阿卡波糖（acarbose） 拜耳醫(yī)藥保健有限公司；DNS（3，5-二硝基水楊酸）、可溶性淀粉 國產(chǎn)分析純；葡萄糖酶法測(cè)定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；胰島素ELISA試劑盒 美國R&D公司。

721型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋 國華電器有限公司HH4；CP100MX型-離心機(jī) 日本日立公司；Model680型-酶標(biāo)儀 美國Bio RAD公司；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海參皂苷的制備 海參干粉在室溫下以60%的乙醇浸提，浸提液減壓濃縮后得浸提膏，以水飽和正丁醇萃取浸提膏，正丁醇部分減壓濃縮后蒸干，過大孔樹脂純化的海參皂苷[8]。

1.2.2 大鼠小腸α-糖苷酶的提取 雄性Wistar大鼠乙醚麻醉，剪取整段小腸，在冷的0.9%生理鹽水中反復(fù)沖洗三次，剖開腸腔，以0.9%的生理鹽水沖洗，用載玻片輕輕刮取小腸內(nèi)表面，將刮取物與冷的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）按照1∶10混勻，冰浴勻漿2min，勻漿液10000r/min離心（4℃）30min，取上清液，分裝后-20℃保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.3 酵母α-糖苷酶、鼠腸α-糖苷酶活性測(cè)定 配制20mmol/L的底物PNPG（對(duì)硝基苯酚葡萄糖酯）和酶（酵母α-糖苷酶、鼠腸α糖苷酶）液。反應(yīng)體系為200μL，于各離心管中加入以磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH6.8），然后加不同濃度的海參皂苷溶液140μL（或10μL），使各管海參皂苷濃度分別為（0、0.02、0.04、0.06、0.1mg/mL），再加入20μL酵母α-糖苷酶（或180μL鼠腸α-糖苷酶）液混勻，37℃水浴5min。加入40μL（或10μL）20mmol/L PNPG（對(duì)硝基苯酚葡萄糖酯）為底物，于37℃水浴中反應(yīng)15min后，以1mL 0.1mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，于405nm處比色[10]。

1.2.4 海參皂苷對(duì)酵母-α糖苷酶抑制作用類型的確定 參照文獻(xiàn)[11]方法，海參皂苷溶液濃度分別為0、0.06、0.1mg/mL，底物PNPG體系終濃度為0.1、0.3、0.5、0.8、1.0mg/mL。按照1.2.2方法，以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)初速度對(duì)應(yīng)的吸光度的倒數(shù)（1/OD）為縱坐標(biāo)雙倒數(shù)法作圖，判斷海參皂苷對(duì)酵母α-糖苷酶的抑制類型。

1.2.5 對(duì)α-淀粉酶的抑制作用 參照文獻(xiàn)[12]反應(yīng)體系加入100μL海參皂苷溶液或阿卡波糖溶液200μL豬胰α-淀粉酶、2mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.9）200μL，混勻后37℃水浴15min，再加入1%可溶性淀粉100μL，37℃水浴反應(yīng)5min，向各管分別加入500μL DNS顯色劑，沸水浴5min，冰浴冷卻后稀釋至5mL，于540nm比色。

抑制率（%）=（A1-A2）/A1×100

式中A1、A2分別代表無抑制劑和有抑制劑時(shí)的吸光值。

1.2.6 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組，雄性C57BL/KsJ（db/db）分為模型組和皂苷組（每組6只）。C57BL/KsJ小鼠為正常對(duì)照組（5只），實(shí)驗(yàn)飼料根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)AIN-76配方配制，模型組和對(duì)照組喂正常實(shí)驗(yàn)飼料，皂苷組在實(shí)驗(yàn)飼料中添加0.07%的海參皂苷，喂養(yǎng)4周后，進(jìn)行葡萄糖耐量的測(cè)定，喂養(yǎng)5周后，取全血，測(cè)空腹血糖和胰島素。

1.2.7 葡萄糖耐量、空腹血糖及血胰島素的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水10h，按照2.5g/kg體重灌胃葡萄糖，分別于灌胃后0、30、60和120min后尾靜脈取血，利用葡萄糖氧化酶試劑盒測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的血糖濃度，評(píng)價(jià)葡萄糖耐量?？崭寡逡葝u素水平采用ELISA胰島素試劑盒測(cè)定。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參皂苷對(duì)α-糖苷酶活性的影響

圖1 皂苷、阿卡波糖對(duì)酵母α-糖苷酶及對(duì)鼠腸α-糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibition of sea cucumber saponin and acarbose on the α-glycosidase of yeast and rat intestinal

由圖1（a，b）可以看出海參皂苷可顯著抑制酵母α-糖苷酶的活性，IC50為0.042mg/mL；且對(duì)酵母α-糖苷酶的抑制作用優(yōu)于陽性對(duì)照阿卡波糖（IC50為1.062mg/mL）。對(duì)比圖1（a，b）可知海參皂苷對(duì)鼠腸α-糖苷酶的抑制作用明顯低于陽性對(duì)照阿卡波糖。

2.2 海參皂苷對(duì)酵母-α糖苷酶抑制作用類型的確定

對(duì)海參皂苷抑制酵母α-糖苷酶的作用類型進(jìn)行酶促動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果如圖2所示。在以對(duì)PNPG（硝基苯酚葡萄糖酯）為底物的酵母α-糖苷酶酶促反應(yīng)中加入2種不同濃度（0.06、0.1mg/mL）的海參皂苷溶液后，α-糖苷酶水解底物PNPG的作用明顯被抑制；隨著海參皂苷濃度的增大，最大反應(yīng)速度（Vmax）減小，而表觀米氏常數(shù)（Km）增大；三條雙倒數(shù)直線的交點(diǎn)在橫軸上，因此推斷抑制作用類型屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖2 海參皂苷對(duì)酵母α-糖苷酶抑制作用雙倒數(shù)曲線Fig.2 Lineweaver-Burk plot of the saponin from sea cucumber against yeast α-glycosidase at different concentrations of pNPG

2.3 海參皂苷對(duì)α-淀粉酶活性的影響

圖3 海參皂苷和阿卡波糖對(duì)豬胰α-淀粉酶的抑制作用Fig.3 Inhibition of sea cucumber saponin and acarbose on porcine pancreatic α-amylase

海參皂苷對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用見圖3（a）。海參皂苷對(duì)α-淀粉酶有一定的抑制作用，但是抑制率均較低。阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用較強(qiáng)，且呈現(xiàn)明顯的劑量關(guān)系（IC50為0.004mg/mL），見圖3（b）。

2.4 海參皂苷對(duì)自發(fā)性糖尿病小鼠空腹血糖、胰島素水平及葡萄糖耐受量的影響

結(jié)果如圖4（a、b）所示，模型組空腹血糖和空腹胰島素水平高于正常組，分別高達(dá)15.25mmol/mL和4.19ng/mL，模型組灌胃前血糖值及灌服葡萄糖后各時(shí)間點(diǎn)血糖值均明顯高于正常組，已形成Ⅱ型糖尿病。喂食海參皂苷后，小鼠葡萄糖耐受量明顯得到改善（圖4c）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，海參皂苷組小鼠空腹胰島素水平、空腹血糖值均顯著低于模型組（圖4a、b）。由此可見，海參皂苷可降低自發(fā)性糖尿病小鼠空腹血糖和空腹胰島素水平，并改善其糖耐量異常。

圖4 海參皂苷對(duì)自發(fā)性糖尿病小鼠空腹血糖、空腹胰島素水平及葡萄糖耐受量的影響Fig.4 Effects of sea cucumber saponin on FBG、FINS and Glucose tolerance of saontaneous diabetes mice

3 討論

Ⅱ型糖尿病癥狀主要表現(xiàn)為空腹高血糖、餐后高血糖并伴隨有胰島素抵抗。近年來研究發(fā)現(xiàn)餐后高血糖是引發(fā)糖尿病及其并發(fā)癥的主要因素，特別是對(duì)于Ⅱ型糖尿病人，餐后高血糖對(duì)機(jī)體造成的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過空腹高血糖，所以降低餐后高血糖是預(yù)防和治療糖尿病的重要靶點(diǎn)。α-糖苷酶主要分布于小腸上皮絨毛上，膳食中的多糖，如淀粉，經(jīng)口腔唾液、胰淀粉酶被優(yōu)先消化為分子量較小的低聚糖，隨后α-糖苷酶作用于這些低聚糖的非還原末端，切斷α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，葡萄糖被小腸吸收后進(jìn)入血液循環(huán)，變?yōu)檠荹13]。α-糖苷酶抑制劑通過對(duì)小腸刷狀邊緣α-糖苷酶活性的可逆性抑制作用，延緩多糖、雙糖向葡萄糖的轉(zhuǎn)化，減緩餐后血糖的升高，從而達(dá)到防治糖尿病及其并發(fā)癥的目的[14]。本實(shí)驗(yàn)通過體外研究發(fā)現(xiàn)，海參皂苷可明顯降低α-糖苷酶（酵母α-糖苷酶、鼠腸α-糖苷酶）和豬胰α-淀粉酶的活性，抑制作用與海參皂苷的濃度呈一定的劑量關(guān)系。阿卡波糖是臨床應(yīng)用α-糖苷酶抑制劑，對(duì)哺乳動(dòng)物的α-糖苷酶具有很好的抑制作用[15]，阿卡波糖對(duì)鼠腸α-糖苷酶的抑制效果雖優(yōu)于海參皂苷，但是在抑制酵母α-糖苷酶活性方面的作用明顯低于海參皂苷，這與之前的研究結(jié)果相吻合[16]。由此可見，利用微生物源的生物酶對(duì)生物活性物質(zhì)進(jìn)行篩選或許不盡合理。

本實(shí)驗(yàn)采用添加0.07%海參皂苷的飼料喂養(yǎng)C57db/db小鼠，證實(shí)海參皂苷可明顯抑制口服葡萄糖負(fù)荷后血糖的升高，這可能是通過抑制小腸刷狀邊緣α-糖苷酶的活性，減少葡萄糖的吸收來實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，海參皂苷還可以改善自發(fā)性糖尿病小鼠（C57db/db）的胰島素抵抗。與模型組相比，海參皂苷組空腹胰島素水平降低了20%，空腹血糖值降低了24.6%，由此推測(cè)，海參皂苷可能通過提高胰島素的敏感性增加葡萄糖的利用從而控制血糖。

4 結(jié)論

本文驗(yàn)證了海參皂苷對(duì)自發(fā)性糖尿病小鼠的降血糖作用，對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探究，發(fā)現(xiàn)海參皂苷可體外抑制α-糖苷酶、α-淀粉酶的活性，改善自發(fā)性Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗，可用于Ⅱ型糖尿病的飲食預(yù)防和干預(yù)。

[1]The Diabetes Control and Complications Trial Research Group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus[J].N Engl J Med，1993，329：977-986.

[2]Lebovitz HE.Alpha-glucosidase inhibitors[J].Endocrinol Metab Clin，1997，26：539-551.

[3]H Bischoff bayer AG.Pharmacology of a-glucosidase inhibition[J].European Journal of Clinical Investigation，1994，24：3-10.

[4]Nguyen Hai Dang，NguyenVan Thanh，Phan Van Kiem，et al.Two new triterpene glycosides from the Vietnamese sea cucumber Holothuria scabra[J].Archives of Pharmacal Reaserch，2007，30（11）：1387-1391.

[5]Rajesh Kumar，Ashok Kumar Chaturvedi，Praveen Kumar Shukla，et al.Antifungal activity in triterpene glycosides from the sea cucumber Actinopyga lecanora[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2007，17（15）：4387-4391.

[6]Mamelona J，Pelletier é，Lalancette KG，et al.Quantification of phenolic contents and antioxidant capacity of Atlantic sea cucumber，Cucumaria frondosa[J].Food Chem，2007，104：1040-1047.

[7]胡曉倩，王玉明，任興兵，等.海參主要活性成分對(duì)大鼠脂質(zhì)代謝影響的比較研究[J].食品科學(xué)，2009，30（23）：393-396.

[8]于林芳，王超，王玉明，等.大孔樹脂純化革皮氏海參總皂苷工藝[J].食品科學(xué)，2011，32（12）：1-4.

[9]張素軍，瞿偉菁，周淑云.蒺藜皂苷對(duì)大鼠小腸α-普通糖苷酶的抑制作用[J].中國中藥雜志，2006，3（11）：910-913.

[10]Yong-Mu Kim，Youn-Kab Jeong，Myeong-Hyeon Wang，et al.Inhibitory effect of pine extract on α-glucosidase activity and postprandial hyperglycemia[J].Nutrition，2005（21）：756-761.

[11]田麗梅，王旻，陳衛(wèi).枸杞多糖對(duì)α-糖苷酶抑制作用的系列研究[J].中藥藥理與臨床，2005，21（3）：23-25.

[12]SangeethaR，VedasreeN.Invitroα-amylaseinhibitoryactivity of the leaves ofthespesia populnea[J].ISRN Pharmacol，2012，3：1-4.

[13]石雪萍，姚慧源.苦瓜皂苷降糖機(jī)理研究[J].食品科學(xué)，2008，29（2）：366-368.

[14]王翼，張旭.α-糖苷酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2009，21（9）：4-6.

[15]Siric hai Adisakw attana，Orathai Ler dsuwan kij，Ubonwan Poputtachai，et al.Inhibitory activity of cinnamon bark species and their comb ination effect with acarbose against intestinalαglucosi dase and pancreatic α-amylase[J].Plant Foods Hum Nutr，2011（66）：143-148.

[16]Han Nguyen，Byung Hun Um，Sang Moo Kim.Two unsaturacidswith potentα-glucosidase inhibitory activity purified from the body wall of Sea Cucumber（Stichopus japonicas）[J].Journal of Food Science，2011，76：208-214.