轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值研究及不確定度分析

劉瑛穎 隋志偉 王 晶 傅博強(qiáng)

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013)

0 引言

近年來(lái)，全球農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)取得了巨大發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物種植面積逐年上升。轉(zhuǎn)基因大豆為主要種植的轉(zhuǎn)基因作物，2009 年種植面積達(dá)到6920萬(wàn)公頃，占全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積的52%[1]。

大豆品系GTS 40-3-2是由加拿大孟山都公司(Monsanto)開(kāi)發(fā)的，它使得在大豆種植中可以選用草甘膦做除草劑。GTS40-3-2抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，將矮牽牛Ti 質(zhì)粒(CaMy)中35S啟動(dòng)子控制epsps 基因?qū)氲酱蠖怪仓?，培育成的新大豆品種，其含有的4個(gè)來(lái)源于土壤細(xì)菌(Agrobacteriumspp.CP4)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-膦酸合成酶(epsps)基因，是草甘膦抗性的主要來(lái)源[2]。

轉(zhuǎn)基因大豆在全球范圍的迅猛發(fā)展也使其食用安全和環(huán)境安全問(wèn)題引起了各國(guó)政府和相關(guān)國(guó)際組織的高度重視，紛紛出臺(tái)了轉(zhuǎn)基因生物安全管理相應(yīng)的法規(guī)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性提出了高標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)要求。目前農(nóng)業(yè)部已經(jīng)頒布了轉(zhuǎn)基因大豆定性PCR檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，而我國(guó)卻缺乏轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，這就要求加快對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制可用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)和安全評(píng)價(jià)、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的定量檢測(cè)等領(lǐng)域。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

主要試劑：Taqman PCR master mix試劑盒(美國(guó)ABI)，內(nèi)標(biāo)基因引物、外源基因引物和TaqMan 探針(上海英峻)，植物基因組提取試劑盒(天根生物)。3個(gè)水平的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和純陽(yáng)性材料由上海交通大學(xué)提供。

主要儀器：定量PCR儀 AB7900。

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增體系和條件

根據(jù)植物基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大豆粉中的DNA，經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度、凝膠電泳觀察DNA完整性。參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-5]并通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇并優(yōu)化了插入外源序列特異性引物、探針，選擇大豆內(nèi)源性基因設(shè)計(jì)并優(yōu)化引物和探針，結(jié)果如表1所示。

表1 Taqman探針實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)引物和探針序列信息

續(xù)表

擴(kuò)增體系如表2所示，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，300s；95℃，15s，60℃，60s，45個(gè)循環(huán)。

表2 GTS40-3-2結(jié)構(gòu)特異性與大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的熒光定量PCR擴(kuò)增體系

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)量結(jié)果計(jì)算

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2提取的基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)下面的公式換算成基因組DNA拷貝數(shù)濃度，通過(guò)梯度稀釋法配制成5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)和擴(kuò)增得到的Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？截悢?shù)計(jì)算公式：

Cp=6.02×1023×CDNA/Mw

式中，CDNA為測(cè)定的樣本基因組DNA濃度；Mw為基因組分子量大小，大豆基因組大小為1100Mb。

根據(jù)得到的內(nèi)外源基因的拷貝數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)基因成分的含量，公式如下：

膠塞體系泵入井筒后，隨著溫度的上升和時(shí)間的延長(zhǎng)以及泵注的剪切攪動(dòng)，稠化劑逐漸溶解，交聯(lián)中心離子逐漸釋放，膠塞體系逐漸成膠，最終形成具有高強(qiáng)度和黏彈性的固體膠狀物(見(jiàn)圖2)，120℃下的初始黏度達(dá)30000 mPa·s以上。由于稠化劑濃度較高，且成膠前交聯(lián)劑已與稠化劑充分混合，最終使得半乳甘露聚糖與交聯(lián)劑中心離子形成較為致密的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為高黏彈性的固體狀。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的含量(%)=測(cè)試樣品中外源基因的拷貝數(shù)/(測(cè)試樣品中內(nèi)源基因的拷貝數(shù)×內(nèi)標(biāo)比)×100%

1.4 室內(nèi)重復(fù)性檢查

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室用建立的定量PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個(gè)梯度水平的9個(gè)樣品進(jìn)行了定量分析，以進(jìn)一步確認(rèn)建立的PCR定量方法能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值。

1.5 多家實(shí)驗(yàn)室定值

選擇有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室參加協(xié)同實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室選擇的原則是：1)通過(guò)ISO/IEC 17025的認(rèn)可或CNAS-CL01:2006的資質(zhì)、農(nóng)業(yè)部認(rèn)可；2)或者參加過(guò)能力驗(yàn)證計(jì)劃；3)或者經(jīng)盲樣測(cè)試合格。

2 結(jié)果與討論

2.1 定量PCR實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn)

經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室研究，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2內(nèi)、外標(biāo)準(zhǔn)基因定量PCR的擴(kuò)增效率在0.85以上，線性相關(guān)系數(shù)在0.99以上，說(shuō)明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線適合于轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2樣品的定量檢測(cè)。所有樣品定量分析的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)在25%以內(nèi)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2定量PCR方法的重復(fù)性能夠滿足定量的要求[5](見(jiàn)表3)。

表3 轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2定量PCR檢測(cè)的重復(fù)性結(jié)果

2.2 協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果

參與聯(lián)合定值的各實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個(gè)水平的轉(zhuǎn)基因玉米樣品每種各三瓶進(jìn)行測(cè)定，每瓶進(jìn)行不少于3次的重復(fù)測(cè)試。各家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同比對(duì)結(jié)果如表4～表6所示，參與實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差均達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)[5]。參與實(shí)驗(yàn)室使用了不同定量PCR儀器，主要為ABI系列和Roche。通過(guò)上述建立的PCR實(shí)驗(yàn)方法，各實(shí)驗(yàn)室不同的PCR儀器均得到了好的擴(kuò)增效率和線性相關(guān)系數(shù)，進(jìn)一步說(shuō)明該定量PCR體系適用于不同的PCR儀器，具有很好的穩(wěn)定性。

表4 轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水平A的協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水平B的協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水平C的協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 室間精密度分析

對(duì)各實(shí)驗(yàn)室返回的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2A、B、C三個(gè)水平的實(shí)驗(yàn)室間定量PCR的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為28.08%、24.29%、32.88%。根據(jù)格拉布斯準(zhǔn)則從統(tǒng)計(jì)上剔除離群值后[6]，重新進(jìn)行室間精密度分析，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個(gè)水平的實(shí)驗(yàn)室間定量PCR的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為22.72%、17.83%、27.24%。均小于35%，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的室間精密度能夠滿足定量要求[5]。

3 不確定度評(píng)定

3.1 A類不確定度uA評(píng)定

該分量是通過(guò)測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出的不確定度。通過(guò)剔除多家實(shí)驗(yàn)室定值結(jié)果中的離群數(shù)據(jù)之后，各實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)平均值等精度，因此，A類不確定度的具體計(jì)算方法如下：

轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的A，B，C三個(gè)含量水平的多家實(shí)驗(yàn)室量為：uA(A)= 0.001002；uA(B)=0.001618；uA(C)= 0.00841。

3.2 B類不確定度uB評(píng)估

B類不確定的主要來(lái)源包括：1)移液器帶來(lái)的不確定度；2)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列稀釋帶來(lái)的不確定度；3)內(nèi)外源標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增引入的不確定度；4)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。

3.3 均勻性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uH評(píng)估

ν1=m-1

ν2=m(n-1)

經(jīng)計(jì)算，A、B、C三個(gè)水平的均勻性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:uH(A)=0.202%；uH(B)=0.380%；uH(C)=0.231%。

3.4 穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uS評(píng)估

4℃儲(chǔ)存條件下，6個(gè)月內(nèi)在五個(gè)時(shí)間點(diǎn)上(0、1、2、4和6個(gè)月)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)考察了穩(wěn)定性。以穩(wěn)定性考察的時(shí)間為x軸，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相應(yīng)時(shí)間的特性值為y軸，擬合成一條直線。直線的斜率為b1，截距為b0。

斜率的不確定度s(b1)通過(guò)下式計(jì)算[8]：

穩(wěn)定性對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)為：uS=s(b1)t

式中，t為穩(wěn)定性的考察時(shí)長(zhǎng)(月)。

轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性分別產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，A水平，uS=0.346%；B水平，uS=0.033%；C水平，uS=0.108%。

3.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

考慮到四部分標(biāo)準(zhǔn)不確定度相互獨(dú)立，根據(jù)下面公式合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

A、B、C三個(gè)水平定值部分的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

u(A)=0.41%，u(B)=0.41%，u(C)=0.91%

4 結(jié)論

對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2定量PCR方法進(jìn)行了室內(nèi)研究。組織了7家有資質(zhì)實(shí)驗(yàn)室對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個(gè)水平的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了多家定值，對(duì)多家定值的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得出，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個(gè)水平的轉(zhuǎn)基因含量及標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：水平A定值結(jié)果為 1.08%，不確定度為0.82%(k=2，p=95%)；水平B定值結(jié)果為 2.22%，不確定度為0.82%(k=2，p=95%)；水平C定值結(jié)果為 7.56%，不確定度為1.82%(k=2，p=95%)。

[1] 鐘金傳，吳文良，夏友富.全球轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)展概況.生態(tài)經(jīng)濟(jì)，2005(10)

[2] Monsanto Company.Crop Year/Fiscal Year Financials：Consolidated Restatement Financials.http://www.monsanto.com/monsanto/layout/investor/crop_year/default.asp,2005

[3] Philippe Corbisier，Stefanie Trapmann，David Gancberg，Liesbeth Hannes，Pierre Van Iwaarden，Gilbert Berben，Heinz Schimmel，Hendrik Emons.Quantitative determination of Roundup Ready soybean (Glycine max)extracted from highly processed flour.Anal Bioanal Chem.2005，383(2)，282-290

[4] Swiss Food Manual (Schweizerisches Lebensmittelbuch)

[5] European Network of GMO Laboratories.Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing.2008

[6] ISO Guide 35:2006，Reference materials-general and statistical principles for certification

[7] 全浩，韓永志．標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其應(yīng)用技術(shù)(第二版)[M]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003

[8] 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì).標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值原則和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理[M].北京：中國(guó)質(zhì)檢出版社，2011