麩質(zhì)蛋白過敏原ELISA定量測定能力驗證研究*

王 洋 武利慶 高運華 盛靈慧 楊 彬 王 晶 楊 屹

(1.北京化工大學，北京 100029；2.中國計量科學研究院，北京 100013)

0 引言

食品過敏原屬于食品安全性的范疇，食品過敏原多指那些能對特定人群產(chǎn)生過敏反應的食品中的蛋白質(zhì)。據(jù)報道，90%以上的食品過敏是由蛋、奶、魚、甲殼類、花生、大豆、堅果類及小麥這8類常見食物引起[1]。

小麥是人們?nèi)粘ｏ嬍持械闹饕澄飦碓?，也是主要的食物蛋白來源之一，小麥中蛋白含量占其總體的7%～15%。小麥致敏通常會影響皮膚、內(nèi)臟和呼吸道的健康，引起運動激發(fā)過敏癥、職業(yè)哮喘、鼻炎、接觸性蕁麻癥、乳糜瀉腸炎和麻風皮膚病等不適[2]。麩質(zhì)蛋白是其主要的致敏成分，根據(jù)其在水醇溶液中的溶解情況，可以分為可溶性的醇溶蛋白和不可溶的麥谷蛋白[3]。醇溶蛋白一般是麩質(zhì)蛋白含量的一半，所以，準確檢測谷物中醇溶蛋白的含量，就可以得到其麩質(zhì)蛋白的含量。

食品過敏原的體外檢測方法有很多[4]，ELISA法是其中之一，他具有靈敏度高、重復性好、易操作和應用廣泛等優(yōu)點，而且很多過敏原專用的ELISA試劑盒都已經(jīng)實現(xiàn)商品化，成為應用最多的過敏原檢測方法。其中，雙抗夾心ELISA法和競爭ELISA法應用最為廣泛，國內(nèi)外已有很多關(guān)于雙抗夾心ELISA法和競爭ELISA法定量檢測食物中醇溶蛋白含量的報道[5-8]。

為了考察各個實驗室采用ELISA方法檢測食品過敏原數(shù)據(jù)的可比性，澳大利亞計量院組織了麩質(zhì)蛋白定量檢測國際能力驗證。中國計量科學研究院參加了此次能力驗證，實驗采用的是雙抗夾心ELISA法，用德國拜發(fā)的醇溶蛋白試劑盒測定了比對樣品中的麩質(zhì)蛋白含量并對測定結(jié)果的不確定度進行了評定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

多功能酶標儀；離心機；天平；水??；渦旋儀；排槍。

超純水；異丙醇(色譜純)；乙醇(色譜純)；待測樣品由澳大利亞計量院提供；麩質(zhì)蛋白提取液和麩質(zhì)蛋白檢測試劑盒RIDASCREEN? Gliadin。

1.2 實驗步驟

1)根據(jù)試劑盒提供的標準方法，待試劑盒平衡至室溫后，將樣品稀釋液進行1:5稀釋；二抗儲備液進行1:11稀釋；洗滌緩沖液進行1:10稀釋，備用。

2)根據(jù)試劑盒提供的標準方法，準確稱取0.25g樣品，加入2.5mL提取液，60℃水浴15min。加入7.5mL 68%異丙醇，60℃恒溫水浴10min；60℃水浴10min；2500g離心10min；取80μL上清液，加920μL樣品稀釋液，混勻待測。

3)在酶標板每孔加入100μL標準或樣品溶液，室溫孵育1小時；每孔用250μL洗滌液洗滌三次；每孔加入100μL酶-偶聯(lián)物，室溫反應40min；每孔用250μL洗滌液洗滌三次；每孔加入50μL底物和50μL顯色劑，微微震蕩板，室溫暗反應40min；每孔加入100μL停止液，在450nm測定吸光度。

1.3 結(jié)果計算

試劑盒直接測定出的結(jié)果為提取稀釋后溶液中的醇溶蛋白的含量，通過式(1)根據(jù)稱取樣品的質(zhì)量、樣品溶液體積和稀釋倍數(shù)可計算出樣品中的醇溶蛋白含量：

χGliadin=cGliadin×a×V/m

(1)

式中，cGliadin為稀釋液中醇溶蛋白的含量；a為稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液體積；m為稱取的樣品質(zhì)量。

根據(jù)麩質(zhì)蛋白由50%谷蛋白和50%醇溶谷蛋白組成，將測定出的醇溶蛋白含量乘以2即得到樣品中麩質(zhì)蛋白的含量：

χGluten=2χGliadin

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 試劑盒的選擇與評價

近年來，市場上已有多種商品化的麩質(zhì)過敏原ELISA檢測試劑盒銷售，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)麩質(zhì)過敏原的定性和半定量檢測。但是，大多數(shù)是利用抗體與小麥中的Ω-醇溶谷蛋白片段反應，因而不能等量檢測大麥或黑麥中的醇溶谷蛋白。經(jīng)調(diào)研，最終選擇了德國拜發(fā)公司的RIDASCREEN麩質(zhì)提取檢測試劑盒，該試劑盒符合食品法典修訂標準并獲得AOAC商品化試劑盒的認證，也是歐盟食品法典的強制執(zhí)行方法。

為了保證樣品分析結(jié)果的準確可靠，進行能力驗證樣品分析前，首先對試劑盒定量的準確性、重復性、定量限、檢出限和線性范圍等指標進行了評價和驗證。以試劑盒自帶的0ng/g、5ng/g、20ng/g、40ng/g麩質(zhì)蛋白標準品繪制標準曲線，將10ng/g麩質(zhì)蛋白標準品作為未知樣，進行評價實驗。評價實驗連續(xù)進行3天，每天進行3次平行實驗。計算10ng/g麩質(zhì)蛋白標準品測定結(jié)果與標準值的誤差作為準確度的指標；計算日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)作為重復性的指標；以3倍0ng/g麩質(zhì)蛋白標準品吸光度計算檢出限；以10倍0ng/g麩質(zhì)蛋白標準品吸光度計算定量限。試劑盒的各評價參數(shù)見表1?？梢娫撛噭┖袑?～40ng/g范圍內(nèi)的麩質(zhì)蛋白具有較好的定量能力，能夠滿足此次能力驗證樣品的測定要求。

表1 試劑盒定量能力評價參數(shù)

2.2 能力驗證樣品中麩質(zhì)蛋白含量的測定

此次能力驗證共發(fā)放兩個盲樣，均為研磨后混合均勻的食品粉末，每個樣品各50g。按照所述實驗步驟完成樣品的提取、測定，并按照1.3的方法計算樣品中麩質(zhì)蛋白的含量。每次實驗時兩個樣品分別稱取3個子樣，每個子樣平行測定3次，總共進行3次實驗，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，盲樣S1為高值樣品，S2為低值樣品，低值樣品中的醇溶蛋白含量低于檢出限。高值樣品日內(nèi)變異系數(shù)為3.13%～3.76%，日間變異系數(shù)為4.45%，如表3所示。

表2 比對樣品中麩質(zhì)蛋白含量的測定

表3高值樣品中麩質(zhì)蛋白含量測定結(jié)果

2.3 不確定度評價

本實驗結(jié)果計算的數(shù)學模型為式(1)。根據(jù)數(shù)學模型，不確定度主要來自醇溶蛋白濃度的測定、稀釋因子、加樣體積和樣品稱量。

2.3.1 醇溶蛋白濃度測定

醇溶蛋白濃度測定的不確定度主要來源于方法的重復性、標準品和標準曲線擬合。醇溶蛋白一共測定了3組，每組測定了9個數(shù)據(jù)，共得到27個實驗數(shù)據(jù)，最終結(jié)果為這27個數(shù)據(jù)的平均值。采用A類不確定度評定方法計算吸光度重復性的不確定度分量(n=27)：

根據(jù)文獻[9]計算標準曲線y=ax+b中斜率a和截距b的不確定度：

ua=0.77μg/g，ub=0.94μg/g

所以，由醇溶蛋白濃度測定帶來的不確定度為：

2.3.2 稀釋因子

在實驗過程中，分別使用檢定合格的100μL和1000μL的移液器移取80μL樣品和920μL樣品稀釋液進行樣品稀釋。根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》，100μL和1000μL移液器的最大允許誤差分別為±2.0%和±1.0%，按照均勻分布估計，由此帶來的稀釋因子的不確定度為：

2.3.3 樣品溶液體積

樣品溶液體積總共為10mL，由10mL的移液器分別移取2.5mL和7.5mL的液體得到，根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》，10mL移液器的最大允許誤差分別為±0.6%，按照均勻分布估計，由此帶來的樣品體積的不確定度為：

2.3.4 樣品稱量

根據(jù)JJG 1036—2008《電子天平檢定規(guī)程》，實驗過程中采用6位數(shù)天平稱量0.25g樣品，其最大允許誤差遠遠小于移液器引入的不確定度分量，因此，可忽略由樣品稱量引入的不確定度。

2.3.5 不確定度合成

標準合成不確定度為以上不確定度分量的合成：

取擴展因子k=2，對應于95%的置信概率，則擴展不確定度：

Urel=kuc,rel=0.24；U=0.24×18.9=4.5μg/g

最終測定結(jié)果為：(18.9±4.5)μg/g。

2.4 能力驗證結(jié)果

此次能力驗證由澳大利亞計量院主導，來自世界各國的共11家實驗室參加了此次能力驗證，其中有9個實驗室上報了測定結(jié)果。所有實驗室均采用ELISA方法進行測定，測定的目標蛋白均為醇溶蛋白，結(jié)果如表4和圖1所示。

表4 各實驗室樣品測定結(jié)果

S2樣品為空白樣品，只要測定過程中沒有污染，測定結(jié)果就不會出現(xiàn)問題，所有參加實驗室都成功完成了S2樣品的測定。S1為澳大利亞計量院的定值樣品，定值結(jié)果為(17.6±2.6)mg/kg(見圖1)，所有參加實驗室中只有中國計量科學研究院和8號實驗室測定結(jié)果中心值落在樣品定值結(jié)果范圍內(nèi)。

圖1 S1樣品中麩質(zhì)蛋白含量測定結(jié)果

為了更加科學合理的對能力驗證結(jié)果進行評價，澳大利亞計量院同時采用了z值和En值評價各家實驗室的測定結(jié)果。z值和En值的計算公式分別如下：

(4)

(5)

式中，x為各參加實驗室的測定結(jié)果；X為比對樣品的賦值結(jié)果；σ為樣品賦值結(jié)果的標準偏差，σ=X·CV；Ux為樣品賦值結(jié)果的擴展不確定度；Uχ為測定結(jié)果的擴展不確定度。

若z≤2，說明結(jié)果可信；23，說明結(jié)果不可信；En≤1，說明結(jié)果可信；En>1，說明結(jié)果不可信。各實驗室的z值和En值分別如圖2和圖3所示。

圖2 z值分布圖

若按z值評價(圖2)，中國計量科學研究院以及實驗室3、5、7、8、9的z≤2，證明這些實驗室的測定結(jié)果可靠；若按En值評價(圖3)，中國計量科學研究院以及實驗室8、9的En≤1，說明這些實驗室測定結(jié)果可靠。不論采用z值還是En值評價，中國計量科學研究院以及實驗室8、9的結(jié)果都與澳大利亞計量院結(jié)果一致，通過了此次能力驗證。此次食品過敏原能力驗證數(shù)據(jù)表明中國計量科學研究院已具備準確測定食品中麩質(zhì)蛋白過敏原的能力。

圖3 En值分布圖

3 結(jié)論

過敏原是當前食品安全面臨的一大問題，快速、準確定量食品中的過敏原具有重要的意義。中國計量科學研究院參加澳大利亞計量院組織的本次過敏原國際能力驗證，就是為了檢驗自身的食品過敏原檢測能力。驗證結(jié)果表明中國計量科學研究院的測定結(jié)果與主導實驗室的結(jié)果等效，證明了中國計量科學研究院已具有較好的麩質(zhì)蛋白過敏原定量測定能力。

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