結(jié)核感染T細胞斑點試驗在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值

王立紅 付秀華 張桂芝 李國華 顧巖 高俊珍

據(jù)WHO估計, 2011年全球約有870萬例新發(fā)結(jié)核病患者,140萬例死于結(jié)核病[1]。結(jié)核病已成為全球所有傳染性疾病中成年人的首要死因。2004年WHO報告顯示，結(jié)核病診斷率僅為37%, 即使在發(fā)達國家也僅有50%的結(jié)核病患者通過細菌學方法被證實[2]。因此，尋求一個敏感度及特異度均較高的檢測方法已成為臨床的迫切需求。大量研究表明，結(jié)核特異抗原誘導活化分泌γ干擾素的T 淋巴細胞可作為結(jié)核分枝桿菌感染的一種可靠標志物。酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)(T-SPOT.TB)被認為是目前檢測T淋巴細胞反應(yīng)最靈敏的方法，而且可以應(yīng)用于疫苗的研發(fā)、臨床診斷以及基礎(chǔ)研究等多個方面[3]。目前，國內(nèi)外多數(shù)研究缺乏大樣本的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我院自2011年7月至2012年4月應(yīng)用此項技術(shù)共檢測1042例患者，本研究總結(jié)分析了其中有較完整資料的587例住院患者的檢測結(jié)果,以評價T-SPOT.TB技術(shù)在結(jié)核病診斷及鑒別結(jié)核是否活動方面的應(yīng)用價值。

對象和方法

一、研究對象和試劑來源

1.研究對象：收集2011年7月至2012年4月我院行T-SPOT.TB檢測的587例住院患者，患者來源于風濕科、呼吸科、消化科、胸外科及內(nèi)分泌等多個科室，男232例，女355例，年齡13～88歲，平均年齡(53.30±16.11)歲。按照患者各自最后確診情況，分為結(jié)核性疾病組(亞組分為活動性結(jié)核與陳舊性結(jié)核；肺結(jié)核與肺外結(jié)核)和非結(jié)核性疾病組(亞組分為免疫損害組和非免疫損害組)，收集患者的年齡、性別、病程、臨床表現(xiàn)、T-SPOT.TB、病理、PPD、抗酸桿菌涂片及結(jié)核抗體(Mtb-Ab)等結(jié)果。

結(jié)核性疾病組128例，其中活動性結(jié)核組103例的具體情況見表1，陳舊性結(jié)核組25例(肺結(jié)核18例，結(jié)核性胸膜炎6例，腎結(jié)核1例)；非結(jié)核性疾病組459例，其中免疫損害者[4]241例，非免疫損害者218例。

活動性結(jié)核性胸膜炎診斷標準：①有低熱、盜汗、乏力等結(jié)核中毒癥狀；②超聲檢查提示有胸腔積液，肺部CT檢查提示伴或不伴結(jié)核病灶；③胸腔積液化驗為以單核細胞為主的滲出液，用酶法檢測腺苷脫氨酶(ADA)>45 U/L；④胸腔積液查癌細胞為陰性，癌胚抗原正常；⑤抗結(jié)核治療胸腔積液吸收明顯；⑥胸膜活檢有典型結(jié)核病變(如結(jié)核性肉芽腫或干酪樣病變)，或痰抗酸桿菌涂片陽性；符合①～⑤或⑥，并且抗結(jié)核治療至少2周，活動性結(jié)核性腹膜炎及心包炎的診斷標準與之相同。

活動性肺結(jié)核患者的診斷均符合文獻[4]的標準。陳舊性結(jié)核是指影像學發(fā)現(xiàn)患者肺上出現(xiàn)的典型硬結(jié)、纖維化和鈣化，而患者自身無結(jié)核中毒癥狀，無病理學、細菌學陽性結(jié)果，亦無PPD強陽性結(jié)果及血紅細胞沉降率增快等結(jié)核病活動證據(jù)。在隨后的胸部X線復查時，患者肺部的病變不出現(xiàn)任何變化。或患者曾經(jīng)患過結(jié)核，經(jīng)過治療完全痊愈或未經(jīng)治療自行痊愈者。

2.儀器和試劑：HealForce培養(yǎng)箱，T-SPOT.TB試劑盒(Oxford Immunotec Ltd， 英國)；酶聯(lián)免疫熒光斑點分析儀(AID公司，德國)；Thermo Scien-tific Sorvall ST 40系列離心機、淋巴細胞分離液、Gibco AIM-V、Gibco RPMI 1640細胞培養(yǎng)液(上海復星長征醫(yī)學科學有限公司)。

二、方法

1.分離血外周淋巴細胞：用肝素抗凝管采集患者剛?cè)朐簳r未開始治療前清晨空腹外周血4 ml,常規(guī)分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，用細胞培養(yǎng)基AIM-V將細胞懸起，計數(shù)后細胞懸液濃度調(diào)至1.0×106個/ml。

表1 103例活動性結(jié)核病患者資料

2.制備胸腔、腹腔、心包積液及腦脊液單個核細胞：50 ml無菌注射器留取患者剛?cè)朐何撮_始治療前新鮮非血性胸腔、腹腔或心包積液50 ml,1250 U肝素抗凝。高壓滅菌離心管采集該標本10 ml, 20 ℃、1800 r/min, 離心7 min，離心半徑17.4 cm；棄上清,將管底細胞懸起,培養(yǎng)基洗滌,加培養(yǎng)基3 ml，作稀釋，緩慢加入內(nèi)有3.5 ml淋巴分離液中，使稀釋血液重疊于分離液上。20 ℃、2300 r/min，離心22 min(離心半徑16.9 cm), 取出懸浮于血漿和分離液間的PBMCs，用培養(yǎng)基洗滌2次，20 ℃、1800 r/min，離心7 min (離心半徑17.4 cm)。用細胞培養(yǎng)基AIM-V將細胞懸起, 計數(shù)后調(diào)整細胞懸液濃度至1.0×106個/ml。

3.ELISPOT檢測：在已包被γ干擾素單克隆抗體的96孔板上，分別加入50 μl細胞培養(yǎng)基作為空白對照，50 μl植物血凝素作為陽性對照，50 μl結(jié)核分枝桿菌特異性混合多肽ESAT-6和CFP-10作為刺激源。然后每個孔中加入100 μl上述細胞懸液，每個標本點4個孔。把96孔板放在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h后，用pH值7.4的PBS洗液洗板4次，每次200 μl。然后加入堿性磷酸酶標記的二抗，再4 ℃孵育1.5 h。孵育后用pH值7.4的PBS洗液洗板4次，每次200 μl，最后每孔加入50 μl顯色底物液，室溫避光靜置5 min,去離子水終止反應(yīng)。

4.結(jié)果判定：(1)實驗有效的判定：空白對照內(nèi)斑點形成細胞(spot forming cell, SFC)計數(shù)<10個，且陽性對照孔內(nèi)SFC計數(shù)>20個。(2)陽性結(jié)果的判定：a.檢測孔SFC-陰性孔SFC計數(shù)≥6個；b.空白對照孔內(nèi)SFC計數(shù)≥6個, 檢測孔必須>2倍空白對照孔的SFC計數(shù)。(3)最終SFC計數(shù)判讀：檢測孔內(nèi)SFC計數(shù)-陰性對照孔內(nèi)的SFC計數(shù)×4，結(jié)果記作：SFC/106，其中一項陽性結(jié)果則結(jié)果判定為陽性，陽性閾值是結(jié)果≥24個SFCs/106。試驗全程由我院風濕免疫科化驗室經(jīng)過專業(yè)化培訓的實驗員操作。

5.統(tǒng)計學方法：檢測結(jié)果用SPSS 16.0 軟件處理，計量資料為非正態(tài)分布，采用中位數(shù)和上下四分位數(shù)表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.結(jié)核性疾病患者T-SPOT.TB檢測結(jié)果：活動性結(jié)核與陳舊性結(jié)核病患者混合肽ESAT-6和CFP-10總SFC中位數(shù)分別為502個/106PBMCs和430個/106PBMCs, 四分位數(shù)間距(P25, P75)分別為(217個/106PBMCs,1287個/106PBMCs)和(140個/106PBMCs,1303個/106PBMCs)，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，差異無統(tǒng)計學意義(U=429.5，P=0.585)。肺結(jié)核與肺外結(jié)核患者混合肽ESAT-6和CFP-10總SFC中位數(shù)分別為456個/106PBMCs和528個/106PBMCs, 四分位數(shù)間距(P25, P75)分別為(264個/106PBMCs,950個/106PBMCs)和(186個/106PBMCs,1244個/106PBMCs)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(U=1083.0，P=0.871)。

2.本組患者T-SPOT.TB檢測結(jié)果及與其他檢測方法的比較：本組587例患者中T-SPOT.TB陽性者187例,其中確診結(jié)核病患者106例，陽性預測值56.68%(106/187)；400例陰性者中確診非結(jié)核病患者378例，陰性預測值 94.50%(378/400)(表2)。T-SPOT.TB檢測結(jié)果與患者的性別、年齡、病程無關(guān)。PPD、抗酸桿菌涂片、Mtb-Ab診斷結(jié)核病的特異度分別為91.87%(192/209)、100.00%(302/302)、93.42%(71/76)，均高于T-SPOT.TB的特異度[82.35%(378/459)]，組間比較采用χ2檢驗， T-SPOT.TB與PPD比較(χ2=10.382,P=0.01)、T-SPOT.TB與抗酸桿菌涂片比較(χ2=33.842,P=0.00)、T-SPOT.TB與Mtb-Ab比較(χ2=5.921,P=0.08),差異均有統(tǒng)計學意義，其余比較結(jié)果見表3。

討 論

近年來, T-SPOT.TB 試驗技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌感染診斷方面被證明具有較高的敏感度和特異度, 且此項技術(shù)于2006年通過了英國國家臨床最優(yōu)化研究所(National Institute of Clinical Excellence,NICE)認證,相關(guān)報道日益增多[2,5]。一項薈萃了3個研究的Mata分析[6]中，2個是分別在南韓和日本普通流行區(qū)的研究，T-SPOT.TB的特異度分別為84.73% (111/131)、83.33%(70/84)；1個是在德國低流行區(qū)的研究，T-SPOT.TB的特異度為97.50% (39/40)。本研究非結(jié)核性疾病患者中免疫損害者與非免疫損害者T-SPOT.TB的特異度分別為71.37% (172/241)、94.50%(206/218)。這些研究結(jié)果提示在低危人群檢測T-SPOT.TB的特異度高，而檢測有潛在Mtb感染的高危人群時，T-SPOT.TB的特異度明顯降低。

本研究中，陽性預測值56.68%(106/187)，陰性預測值 94.50%(378/400)，活動性結(jié)核病的檢測敏感度為93.20%(96/103)，與Kang等[7]報道的結(jié)果相似，陳舊性結(jié)核病的檢測敏感度為40.00% (10/25)，活動性結(jié)核病與陳舊性結(jié)核病患者的SFC計數(shù)的中位數(shù)分別為502個/106PBMCs、430個/106PBMCs，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(U=429.5,P=0.585)，肺內(nèi)結(jié)核與肺外結(jié)核之間的SFC計數(shù)比較，差異亦無統(tǒng)計學意義(U=1083.0，P=0.871)。提示該試劑盒在結(jié)核病的檢出方面具有較高的敏感度，是篩查結(jié)核病的敏感指標，但不能鑒別結(jié)核病是活動性、陳舊性或潛伏性感染，與國外一些報道相似[8]，而T-SPOT.TB陰性排除結(jié)核病的意義更大。

本研究中，免疫損害者的假陽性率高達28.63%(69/241)，明顯高于非免疫損害者的假陽性率(5.50%，12/218),說明免疫抑制狀態(tài)患者T-SPOT.TB陽性率較高，免疫抑制狀態(tài)并不影響T-SPOT.TB的敏感度，支持Kim等[9]的觀點，這些患者可能有發(fā)生活動性結(jié)核病的潛在風險，需密切隨訪。

本研究中T-SPOT.TB檢測診斷結(jié)核性疾病敏感度為82.81%(106/128),均高于PPD [35.71%(30/84)]、抗酸桿菌涂片[8.74%(9/103)]及Mtb-Ab[14.06%(9/64)]的敏感度。而T-SPOT.TB檢測的特異度為82.35%(378/459),均不及PPD[91.87%(192/209)]、抗酸桿菌涂片[100.00%(302/302)]、Mtb-Ab [93.42%(71/76)]的特異度,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明T-SPOT.TB檢測與現(xiàn)有的一些結(jié)核診斷手段相比，具有明顯的優(yōu)勢，但特異度相對較低，診斷需結(jié)合臨床。

表2 各組患者T-SPOT.TB檢測結(jié)果

注a：特異度；b：假陽性率

表3 T-SPOT.TB檢測與其他結(jié)核診斷方法檢測結(jié)果的比較

注由于是回顧性分析，部分患者未行PPD、抗酸桿菌涂片和Mtb-Ab檢查

本研究中結(jié)核性胸膜炎26例，結(jié)核性腹膜炎11例， T-SPOT.TB的敏感度為100.00%(37/37)；結(jié)核性心包炎2例，陽性者1例，因例數(shù)較少需進一步研究。表明T-SPOT.TB試驗用來診斷活動性結(jié)核性胸膜炎及腹膜炎的敏感度很高，當胸、腹腔積液中無結(jié)核分枝桿菌特異性細胞幾乎可以排除活動性胸膜結(jié)核，但因有一定的假陽性率，故陽性結(jié)果需要綜合其他的臨床表現(xiàn)及相關(guān)檢查明確診斷。

總之，T-SPOT.TB 在結(jié)核病診斷方面具有較高的敏感度[10]，尤其是漿膜腔積液及活動性結(jié)核病[11]，受機體的免疫狀態(tài)影響較小，不受卡介苗接種的影響，在活動性肺結(jié)核、肺外結(jié)核、潛伏性結(jié)核感染及免疫抑制的結(jié)核病患者均能檢測，診斷快速，24 h出結(jié)果，能早期診斷結(jié)核分枝桿菌感染。同時，當結(jié)核分枝桿菌被清除后，效應(yīng)T細胞即消失，故檢測效應(yīng)T淋巴細胞可進行臨床療效評估。由于效應(yīng)T細胞有向胸膜腔聚集的特點，故檢測胸腔積液中的單個核細胞能更加靈敏、準確地反應(yīng)結(jié)核分枝桿菌感染的狀態(tài)，與外周血T-SPOT.TB聯(lián)合應(yīng)用，能更有效、準確地診斷結(jié)核性胸膜炎。T-SPOT.TB試驗也存在一些不足，其檢測步驟繁瑣,價格昂貴,對實驗室和技術(shù)要求較高，限制了其在基層醫(yī)院的開展；另外，尚缺少大量、客觀的臨床試驗數(shù)據(jù)。此外,結(jié)核分枝桿菌感染后的免疫反應(yīng)與結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系尚未完全明了，所以T-SPOT.TB檢測尚不能完全鑒別結(jié)核病是否為活動性、陳舊性或潛伏性。

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