肺結(jié)核患者全血γ干擾素釋放試驗影響因素的探討

楊新婷 楊揚 杜鳳嬌 卜建玲 梁清濤 李琦 陳效友

機體在感染結(jié)核分枝桿菌后，體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，致敏的T淋巴細(xì)胞在體外再次受到結(jié)核分枝桿菌特異抗原的刺激時，會分泌并釋放IFN-γ，這就是γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRAs)所依據(jù)的基本原理。其所選用的結(jié)核分枝桿菌特異抗原是來自于RD1區(qū)的2個早期分泌蛋白：早期分泌抗原靶-6(early secretory antigenic target, ESAT-6)與培養(yǎng)濾過蛋白-10(culture filtrate protein，CFP-10)；因其僅存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，在所有的卡介苗和絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中缺乏，因此可保證其較高的特異性。此外，ESAT-6和 CFP-10還是重要的T細(xì)胞抗原，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生記憶性免疫應(yīng)答[1-2]。

目前已經(jīng)有2個商業(yè)化的IGRAs的試劑盒分別通過美國和歐洲FDA的批準(zhǔn)得以在臨床上用于診斷結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)和輔助診斷活動性肺結(jié)核(active tuberculosis，ATB)。第一種是酶聯(lián)免疫斑點實驗(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)，其商品化的試劑盒為T-SPOT.TB(T-SPOT)試劑盒，試驗需要分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，然后與RD1區(qū)抗原共同孵育，使用酶聯(lián)免疫斑點的方法檢查分泌干擾素的特意效應(yīng)T淋巴細(xì)胞；第二種是方法是全血γ干擾素釋放試驗，其商品化試劑盒為QuantiFERON-TB GOLD(QFT-G)和QuantiFERON-TB GOLD In Tube(QFT-GIT)，其主要優(yōu)勢為不用分離PBMC，直接將肝素化的全血與RD1區(qū)抗原共同孵育，使用ELISA的方法檢測彌散至血漿中IFN-γ的水平來達(dá)到診斷的目的。由于采集的血漿可以保存，再加上操作簡便、技術(shù)簡單，在免疫功能正常的人群中有著和ELISPOT一樣好的敏感度和特異度，這就使得全血γ干擾素釋放試驗更加適用于我國經(jīng)濟基礎(chǔ)薄弱的國情和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的研究。全血γ干擾素釋放試驗作為體外細(xì)胞免疫的診斷試驗，近年來用于臨床活動性肺結(jié)核的輔助診斷，在復(fù)雜的臨床工作中，結(jié)核病患者的不同狀態(tài)、菌量負(fù)荷、淋巴細(xì)胞數(shù)量、疾病嚴(yán)重程度均有可能影響細(xì)胞免疫狀態(tài)從而影響實驗結(jié)果，本研究擬就3種抗原刺激下的全血干擾素釋放試驗在肺結(jié)核患者中的影響因素進(jìn)行初步探討。

資料和方法

一、一般資料

選取2010年6月至2012年6月期間首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院住院肺結(jié)核患者、新職工和健康體檢的學(xué)生志愿者共計141例(名)，男86例(名)，女55例(名)，所有受檢者均為HIV陰性，無妊娠，無應(yīng)用免疫抑制劑和免疫增強劑史，抗結(jié)核治療<1周。

二、選例標(biāo)準(zhǔn)

菌陽肺結(jié)核組：痰集菌連續(xù)至少2次(+)或痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性至少1次；共計44例，年齡(46.6±18.4)(17～90)歲。菌陰肺結(jié)核組：至少3次痰集菌及1次痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性，具有典型活動性肺結(jié)核臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)，排除其他非結(jié)核肺部疾病，經(jīng)抗結(jié)核治療病變吸收良好病情好轉(zhuǎn)的患者；共計47例，年齡(38.3±16.8)(16～76)歲。陳舊性肺結(jié)核組：有或無明顯的結(jié)核病史，無結(jié)核病的臨床癥狀和體征，胸部X線或CT發(fā)現(xiàn)硬結(jié)、條索、鈣化病灶；共計15例，年齡(57.4±12.6)(20～76)歲。健康對照組：為新職工和健康體檢的學(xué)生，無明顯的結(jié)核病接觸史、無臨床癥狀和體征、X線胸片檢查無異常表現(xiàn)、無其他疾病的健康人群；共計35名，年齡(21.8±2.11)(18～27)歲。為探討肺結(jié)核患者胸部CT病變廣泛程度對實驗結(jié)果的影響，根據(jù)結(jié)核病患者(包括菌陽及菌陰肺結(jié)核組和陳舊性肺結(jié)核組)影像學(xué)特點，將每一個肺段計為1分，病變累及超過1/2肺段的計為1分，不足1/2肺段的計為0.5分，累計得出每一位肺結(jié)核患者的CT評分，按是否≥4分將患者分為肺部病變累及少組(0～3.9分)和肺部病變累及多組(4～15分)。

該項研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會審核并通過，征得受試對象同意并簽署知情同意書。

三、試驗方法

標(biāo)本收集和檢測：結(jié)核病組患者于入院次日清晨抽取空腹靜脈血5 ml，置于真空肝素抗凝管中；健康對照組統(tǒng)一采血，清晨抽取空腹靜脈血5 ml，置于真空肝素抗凝管中。采血后6 h內(nèi)將靜脈血1 ml加入24孔培養(yǎng)板內(nèi)共5孔，每孔依次加入聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates, PHA)(陽性對照)、PPD、ESAT-6、 ESAT-6/CFP-10和生理鹽水(陰性對照)并于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過夜約16～22 h，次日收集血漿至少300 μl，于-20 ℃保存；收集的血漿采用美國BD公司生產(chǎn)的IFN-γ檢測試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行操作?？乖慕K濃度分別為PHA(20 μg/ml)、PPD(20 μg/ml)、ESAT-6(40 μg/ml)、 ESAT-6/CFP-10(20 μg/ml)，最后1孔加入等體積生理鹽水。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、各抗原刺激后健康對照組和活動性結(jié)核病患者組血漿中IFN-γ的含量

分別以抗原ESAT-6、 ESAT-6/CFP-10融合抗原和抗原PPD刺激，檢測刺激后血漿中IFN-γ含量，活動性肺結(jié)核患者組顯著高于健康對照組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

二、不同影響因素下抗原刺激后IFN-γ含量

(一)菌陽和菌陰肺結(jié)核患者組的比較

比較3種抗原(ESAT-6、ESAT-6/CFP-10和PPD)刺激后菌陽肺結(jié)核組和菌陰肺結(jié)核組間血漿IFN-γ含量，結(jié)果顯示，菌陽肺結(jié)核組與菌陰肺結(jié)核組之間IFN-γ含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

(二)陳舊性肺結(jié)核組、菌陽肺結(jié)核組和菌陰肺結(jié)核組的比較

在3種抗原刺激后，比較陳舊性肺結(jié)核組、菌陰肺結(jié)核組和菌陽肺結(jié)核組間血漿IFN-γ含量后發(fā)現(xiàn)，各抗原表現(xiàn)復(fù)雜，ESAT-6和ESAT-6/CFP-10抗原刺激后分泌IFN-γ的量在菌陰肺結(jié)核組和陳舊性肺結(jié)核組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ESAT-6抗原刺激后分泌IFN-γ的量在菌陽肺結(jié)核組和陳舊性肺結(jié)核組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但ESAT-6/CFP-10抗原刺激后分泌IFN-γ的量在菌陽肺結(jié)核組和陳舊性肺結(jié)核組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，PPD在菌陰肺結(jié)核組和陳舊性肺結(jié)核組、菌陽肺結(jié)核組和陳舊性肺結(jié)核組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3，4)。

表1 各抗原刺激后健康對照組和活動性肺結(jié)核患者組血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分?jǐn)?shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，因此用中位數(shù)(M)表示，括號內(nèi)為IFN-γ含量的最小值和最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原和PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

表2 各抗原刺激后菌陽和菌陰肺結(jié)核患者組血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分?jǐn)?shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，因此用中位數(shù)(M)表示，括號內(nèi)為IFN-γ含量的最小值～最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

(三)不同評分結(jié)果的肺結(jié)核患者IFN-γ含量

3種抗原刺激后發(fā)現(xiàn)，病變面積大(4～15分)的患者ESAT-6和ESAT-6/CFP-10刺激后血漿IFN-γ含量低于病變面積小的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而PPD刺激后血漿IFN-γ含量在兩組之間接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

(四)不同的外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)結(jié)果患者的IFN-γ含量

外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)分為<1.0×109/L組和≥1.0×109/L組，3種抗原刺激后結(jié)果顯示，血漿IFN-γ含量在<1.0×109/L組顯著低于≥1.0×109/L組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表6)。

表3 各抗原刺激后菌陽肺結(jié)核組與陳舊性肺結(jié)核組患者血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分?jǐn)?shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，因此用中位數(shù)(M)表示，括號內(nèi)為IFN-γ含量的最小值～最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

表4 各抗原刺激后菌陰肺結(jié)核組與陳舊性肺結(jié)核組患者血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分?jǐn)?shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，因此用中位數(shù)(M)表示，括號內(nèi)為IFN-γ含量的最小值和最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

表5 各抗原刺激后不同病變范圍的肺結(jié)核患者血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分?jǐn)?shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，因此用中位數(shù)(M)表示，括號內(nèi)為IFN-γ含量的最小值～最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

表6 各抗原刺激后不同的淋巴細(xì)胞計數(shù)的結(jié)核病患者血漿中IFN-γ的含量

注本試驗中部分?jǐn)?shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，因此用中位數(shù)(M)表示，括號內(nèi)為IFN-γ含量的最小值～最大值；E、E/C、D分別表示以ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD為抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量

討 論

全血γ干擾素釋放試驗作為新的體外細(xì)胞免疫檢測的手段，因其不受卡介苗接種后的交叉反應(yīng)，以及不受絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的影響，主要用于LTBI的診斷[3]，其敏感度和特異度可以高達(dá)90%以上[4-6]；盡管IGRAs目前尚不能很好地鑒別LTBI和ATB，但因其在ATB中很好的陽性檢出率[7-8]，近年來被廣泛用于ATB的輔助診斷。在活動性肺結(jié)核中，ELISPOT的總敏感度波動于77%～79%之間[9]，QFT-IT波動于55%～58%之間[10-11],在探討其敏感度降低的原因上，多數(shù)學(xué)者推測可能為ATB患者臨床復(fù)雜多樣，菌量負(fù)荷、病變廣泛程度、疾病嚴(yán)重程度、年齡、基礎(chǔ)疾病、營養(yǎng)狀態(tài)等均可導(dǎo)致其細(xì)胞免疫功能低下從而影響實驗結(jié)果，本研究擬在結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷、病變的活動性、影像學(xué)和外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)4個方面來探討這些因素對全血干擾素釋放試驗的影響。

痰菌陽性常提示體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌菌量負(fù)荷較重，機體結(jié)核分枝桿菌應(yīng)該處于活躍復(fù)制的階段，結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白如ESAT-6和CFP-10的分泌量就會較高；同樣菌陽的患者往往病情較重，細(xì)胞免疫功能降低。在本研究中，兩組之間IFN-γ的分泌量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示本研究中的3種抗原刺激所引起的IFN-γ的分泌量不受是否排菌的影響，因此該試驗對菌陰肺結(jié)核的診斷有著重要的意義。相似的結(jié)論可見于其他的研究報告[12]。

陳舊性肺結(jié)核是指無臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)為硬結(jié)條索鈣化且痰菌陰性的人群。我國屬于結(jié)核病高流行地區(qū)，人群感染結(jié)核分枝桿菌比率普遍較高，部分人群自身免疫和營養(yǎng)功能良好而獲得自愈。在筆者探討該方法能否區(qū)別陳舊性肺結(jié)核和菌陽肺結(jié)核和菌陰肺結(jié)核中，3種抗原呈現(xiàn)不一致的表現(xiàn)，分析其主要原因可能與陳舊性肺結(jié)核組樣本量過少有關(guān)。此外，結(jié)核分枝桿菌潛伏感染、活動性結(jié)核病、陳舊性肺結(jié)核只是機體感染結(jié)核分枝桿菌的不同階段，反映了機體免疫系統(tǒng)在對抗結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入機體后的一系列過程，其三者之間的界限很難界定。無論哪個階段，機體都曾經(jīng)感染過結(jié)核分枝桿菌，體內(nèi)均存在結(jié)核分枝桿菌特異的記憶T淋巴細(xì)胞，因此在體外再次受到結(jié)核分枝桿菌特異抗原的刺激時，均會釋放分泌IFN-γ。同樣復(fù)雜矛盾的結(jié)果在對ATB和LTBI的比較中也能看到，即基于ESAT-6和CFP-10抗原的干擾素釋放試驗并不能區(qū)分活動性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染[13]。另一個主要原因可能是我國為結(jié)核病高感染率國家，部分人群高暴露于結(jié)核分枝桿菌環(huán)境中，在部分陳舊性肺結(jié)核患者中，盡管機體已經(jīng)清除了結(jié)核分枝桿菌的感染，但是由于持續(xù)暴露于結(jié)核分枝桿菌的環(huán)境之中[14]，從而機體長久保留了效應(yīng)T淋巴細(xì)胞[15]。

肺部病變累及的面積常常反應(yīng)結(jié)核病的嚴(yán)重程度。在本研究中，對24例病變累及4個肺段以上和82例不足4個肺段的肺結(jié)核患者抗原刺激的IFN-γ分泌量的比較上，其中ESAT-6和ESAT-6/CFP-10融合抗原無論在IFN-γ的分泌量和IFN-γ分泌的陽性率之間差異都有統(tǒng)計學(xué)意義；其可能的原因為在重癥肺結(jié)核患者中，細(xì)胞免疫功能受到抑制，CD4+T淋巴細(xì)胞的功能受到抑制[16]。

參與抗原特異IFN-γ分泌的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞主要是CD4+T淋巴細(xì)胞，因此，外周血淋巴細(xì)胞的絕對值可能對結(jié)果產(chǎn)生影響[17]。結(jié)果顯示，外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)<1.0×109/L和外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)≥1.0×109/L兩組之間抗原刺激的IFN-γ分泌量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示外周血淋巴細(xì)胞的數(shù)量對試驗結(jié)果可能產(chǎn)生影響，相似的結(jié)論主要在HIV與Mtb雙重感染的人群中得到證實。

本研究旨在初步探討影響干擾素釋放試驗的因素，部分組別因選例困難導(dǎo)致入組人數(shù)偏少，需要進(jìn)一步擴大樣本量探討陳舊性肺結(jié)核與活動性肺結(jié)核的干擾素釋放試驗的差異；此外，根據(jù)研究顯示，淋巴細(xì)胞數(shù)量對實驗結(jié)果有影響，下一步需要對淋巴細(xì)胞進(jìn)行分組，進(jìn)一步探討CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量對實驗結(jié)果的影響。

基于RD1區(qū)抗原刺激的全血γ干擾素釋放試驗在菌量負(fù)荷的影響因素下的IFN-γ分泌量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是受到外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)和病變累及程度的影響。各抗原對疾病的活動性表現(xiàn)不一，需要擴大樣本量進(jìn)一步證實。

[1] Elhay MJ, Oettinger T, Andersen P. Delayed-type hypersensitivity responses to ESAT-6 and MPT64 fromMycobacteriumtuberculosisin the guinea pig. Infect Immun,1998,66(7):3454-3456.

[2] Dillon DC, Alderson MR, Day CH，et al. Molecular and immunological characterization ofMycobacteriumtuberculosisCFP-10, an immunodiagnostic antigen missing inMycobacteriumbovisBCG. J Clin Microbiol,2000,38(9)：3285-3290.

[3] 熊勇超， 侯月云， 趙建忠，等. γ干擾素釋放試驗在檢測結(jié)核分枝桿菌潛伏感染中的應(yīng)用.中國防癆雜志，2012，34(9):613-616.

[4] Brock I, Weldingh K, Lillebaek T, et al. Comparison of tuberculin skin test and new specific blood test in tuberculosis contacts. Am J Respir Crit Care Med,2004, 170(1):65-69.

[5] Ewer K, Deeks J, Alvarez L, et al. Comparison of T-cell-based assay with tuberculin skin test for diagnosis ofMycobacteriumtuberculosisinfection in a school tuberculosis outbreak. Lancet,2003, 361(9364):1168-1173.

[6] Lalvani A, Pathan AA, Durkan H, et al. Enhanced contact tracing and spatial tracking ofMycobacteriumtuberculosisinfection by enumeration of antigen-specific T cells. Lancet, 2001, 357(9273):2017-2021.

[7] 楊新婷，賈紅彥，李琦，等. 全血γ干擾素釋放試驗在菌陰肺結(jié)核中診斷價值的臨床觀察. 中國臨床醫(yī)生，2013，41(3):42-45.

[8] 曾誼，馮梟，宋梅梅，等. 酶聯(lián)免疫斑點試驗在菌陰肺結(jié)核診斷中的價值. 中國防癆雜志，2012，34(2)：100-102.

[9] Menzies D, Pai M, Comstock G. Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research. Ann Intern Med,2007, 146(5):340-354.

[10] Dewan PK, Grinsdale J, Kawamura LM. Low sensitivity of a whole blood interferon-gamma release assay for detection of active tuberculosis. Clin Infect Dis, 2007, 44(1):69-73.

[11] Dogra S,Narang P,Mendiratta DK，et al. Comparison of a whole blood interferon- gamma assay with tuberculin skin testing for the detection of tuberculosis infection in hospitalized children in rural India. J Infect, 2007, 54(3):267-276.

[12] Chen X, Yang Q, Zhang M, et al. Diagnosis of active tuberculosis in China using an in-house gamma interferon enzyme-linked immunospot assay. Clin Vaccine Immunol， 2009,16(6):879-884.

[13] Ravn P, Munk ME, Andersen AB, et al. Prospective evaluation of a whole-blood test usingMycobacteriumtuberculosis-specific antigens ESAT-6 and CFP-10 for diagnosis of active tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol，2005,12(4): 491-496.

[14] 劉旭輝，樂軍，張忠順，等. γ-干擾素釋放試驗(IGRA)的診斷價值探討(高感染率背景下的研究結(jié)果).中國防癆雜志，2010，32(12):801-805.

[15] Dheda K, Pooran A, Pai M, et al. Interpretation ofMycobacteriumtuberculosisantigen-specific IFN-gamma release assays (T-SPOT.TB) and factors that may modulate test results. J Infect, 2007,55(2):169-173.

[16] 于春寶,左云,王俊玲,等.肺結(jié)核病人細(xì)胞免疫功能的研究. 臨床肺科雜志，2008,13(2): 138-139,141.

[17] 楊新婷，賈紅彥，李琦，等. 全血γ干擾素釋放試驗在菌陰肺結(jié)核中診斷價值的臨床觀察. 中國臨床醫(yī)生,2013,41(3):42-45.