含銅不銹鋼對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、增殖及凋亡的影響

徐璐　張揚(yáng)　楊柯等

[摘要] 目的 觀察含銅不銹鋼對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、增殖及凋亡的影響，并與316L不銹鋼進(jìn)行比較。方法 將血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于兩種材料表面，在培養(yǎng)1、2、3 d后，應(yīng)用吖啶橙染色及甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞在兩種材料表面黏附和增殖活性。并制備兩種材料的浸提液，用浸提液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 熒光顯微鏡下，細(xì)胞在兩種材料表面均伸展良好，呈鋪路石狀生長(zhǎng)。在培養(yǎng)1、2 d時(shí)，含銅不銹鋼組黏附的細(xì)胞數(shù)多于316L不銹鋼組（P<0.05）；3 d時(shí)兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MTT結(jié)果顯示，含銅不銹鋼組在1、2 d的吸光度值高于316L不銹鋼組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而在培養(yǎng)3 d后，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

義（P>0.05）。316L不銹鋼組的早期凋亡率高于含銅不銹鋼組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 含銅不銹鋼較

316L不銹鋼更利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及增殖，并可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的早期凋亡率。

[關(guān)鍵詞] 含銅不銹鋼； 血管內(nèi)皮細(xì)胞； 黏附； 增殖； 細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R 783.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.005 在正畸治療中，支抗控制貫穿于整個(gè)治療過程，是治療成敗的重要因素之一[1]。微種植體的支抗作用

是通過種植釘與骨界面的組織學(xué)機(jī)械鎖結(jié)和骨結(jié)合，從而抵抗一定限度內(nèi)的矯治力[2]。在種植體愈合過程

中，新生血管的形成早于成骨活動(dòng)的開始[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的調(diào)節(jié)因子具有調(diào)控成骨細(xì)胞趨化、增殖及分化的功能[4]。而細(xì)胞的生物學(xué)行為受生物材料自身性能的影響[5]。因此，不同種植材料很可能會(huì)影響種植體-骨界面血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)性狀。中國(guó)科學(xué)院金屬研究所研發(fā)的含銅不銹鋼具有良好的抗菌性能和生物相容性，能有效預(yù)防種植體周圍細(xì)菌感染的發(fā)生[6-7]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察含銅不銹鋼對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、增殖及凋亡情況的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 316L不銹鋼為醫(yī)用級(jí)不銹鋼，成分：Cr18%，Ni12%，其余為Fe。含銅不銹鋼（316L-

Cu），成分：Cr18%，Ni12%，Cu4%，其余為Fe，材料由中國(guó)科學(xué)院金屬研究所提供。

1.1.3 主要試劑和設(shè)備 DMEM、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（di-methylsulfoxide，DMSO）、胰蛋白酶（Sigma公司，美國(guó)），胎牛血清（杭州四季青生物有限公司），吖啶橙

（上?；瘜W(xué)試劑公司），Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司），熒光倒置顯微鏡（Nikon公司，日本），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)），

自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀（Tecan公司，奧地利）。

1.2 方法

1.2.1 試件的制備 將含銅不銹鋼和316L不銹鋼制備成兩種規(guī)格試件。一種為直徑10 mm、厚2 mm，各15片，用于黏附實(shí)驗(yàn)和增殖活性檢測(cè)；另一種為直徑25 mm、厚2 mm，各5片，用于制備浸提液。上述材料經(jīng)超聲清洗、干燥，高溫高壓（33 MPa、121 ℃）滅

菌處理后備用。

1.2.2 浸提液的制備 將直徑25 mm、厚2 mm的兩種不銹鋼材料置于6孔培養(yǎng)板中，按試件表面積與培養(yǎng)液之比為3 cm2·mL-1加入DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，浸泡72 h后收集浸提液。

1.2.3 黏附和增殖活性檢測(cè) 將直徑10 mm、厚2 mm的兩種不銹鋼試件置于無菌24孔板中。用0.25%胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，制備成密度為每毫升2×104個(gè)的細(xì)胞懸液，接種到各材料表面，靜置3 h后，從各孔板側(cè)壁緩慢加入DMEM培養(yǎng)基1 mL。標(biāo)準(zhǔn)條件下分別培養(yǎng)1、2、3 d后，將兩種材料各取出2片，PBS沖洗3次，95%乙醇固定10 min，晾干，加入0.1 mg·mL-1吖啶橙染液，0.1 mol·L-1氯化鈣分色。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞在不同材料表面的黏附情況，隨機(jī)選取上、下、左、右、中5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。用MTT法檢測(cè)兩種材料表面血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性。在培養(yǎng)1、2、3 d后，分別取出兩種不銹鋼材料各3片，PBS沖洗后，置于一預(yù)先加入DMEM培養(yǎng)液的新24孔板內(nèi)。每孔加入5 mg·mL-1的MTT試劑80 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入450 μL DMSO，37 ℃下靜置2 h，待藍(lán)紫色結(jié)晶物徹底溶解后，振蕩10 min。將每孔中的液體按每孔150 μL吸入96孔板中，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值（A值）（波長(zhǎng)490 nm），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將濃度為每毫升2×105個(gè)的血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于3塊6孔板中，分別設(shè)計(jì)為含銅不銹鋼組、316L不銹鋼組和對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后，用浸提液置換孔板中的培養(yǎng)液，對(duì)照組用新培養(yǎng)液置換，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，1 000 r·min-1下離心后重懸，制成單細(xì)胞懸液，分別加入Annexin V-FITC和PI，避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，對(duì)黏附在材料表面的細(xì)胞數(shù)及增殖活性采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，對(duì)細(xì)胞凋亡率采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

熒光顯微鏡下，細(xì)胞呈多角形，鋪路石樣排列（圖1）。在培養(yǎng)1、2 d后，含銅不銹鋼組材料表面黏附的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)明顯多于316L不銹鋼組（P<0.05）；而在3 d后兩組材料表面黏附的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量差異不明顯（P>0.05）（圖2）。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

培養(yǎng)1、2 d時(shí)，含銅不銹鋼組A值高于316L不銹鋼組（P<0.05）；而培養(yǎng)3 d時(shí)，兩組A值間差異不明顯（P>0.05）（圖3）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

各組細(xì)胞均以正常細(xì)胞為主，凋亡細(xì)胞在各組間分布不均。316L不銹鋼組早期凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞多于含銅不銹鋼組和對(duì)照組（圖4）。

2.4 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

316L不銹鋼組、含銅不銹鋼組、對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為5.23%±0.35%、1.96%±0.18%、1.45%±0.15%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種不銹鋼組與對(duì)照組相

比，細(xì)胞凋亡率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩

種不銹鋼組相比，細(xì)胞凋亡率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

Fig 2 The numbers of endothelial cells on two kinds of materials

surface

Fig 3 Proliferation of endothelial cells on two kinds of materials

surface

3 討論

微種植體支抗在正畸臨床應(yīng)用中較傳統(tǒng)支抗方式相比，具有穩(wěn)定、舒適、不依賴于患者配合等優(yōu)點(diǎn)，提供了一種相對(duì)穩(wěn)定的口內(nèi)強(qiáng)支抗。目前使用的微種植體材料，一般為純鈦、鈦合金及不銹鋼種植體。鈦的生物相容性較好，骨結(jié)合能力強(qiáng)，但其材質(zhì)較脆，易折斷。不銹鋼與鈦相比，具有良好的延展性和強(qiáng)度，穿透能力強(qiáng)，可抵抗一定程度的旋轉(zhuǎn)力，降低種植體折斷的風(fēng)險(xiǎn)。但在臨床應(yīng)用中，種植體周圍炎的發(fā)生而導(dǎo)致種植體松動(dòng)、脫落已成為微種植體失敗的重要原因之一[8]。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的

含銅不銹鋼是一種集結(jié)構(gòu)與功能于一體的新型生物醫(yī)用材料。含銅不銹鋼在體內(nèi)會(huì)釋放微量的銅離子，經(jīng)證明能有效地殺滅引起種植體周圍炎的常見致病菌[7]，因此是一種極具開發(fā)潛力的微種植體材料。

種植體植入后起初被凝血塊包繞，隨后成骨細(xì)胞分化并參與骨形成[9]。骨形成是骨內(nèi)微環(huán)境中血管

內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間共同作用的結(jié)果[10]。相關(guān)研究表明：血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的血管發(fā)

生因子能促發(fā)絲裂原反應(yīng)，在骨結(jié)節(jié)的形成中發(fā)揮重要作用[11]。同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的內(nèi)皮素-1

可結(jié)合成骨細(xì)胞膜上存在的相應(yīng)受體，從而刺激骨形成[12]。而血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮可通過旁

分泌的形式作用于破骨細(xì)胞，抑制其骨吸收功能[13]。

以上結(jié)果提示：血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的調(diào)節(jié)因子對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均具有調(diào)控作用。此外，種植體的愈合過程必須依賴充分的血供，血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的新生血管為氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物的運(yùn)輸提供通道。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞為種植體界面的愈合提供了良好的生物學(xué)基礎(chǔ)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞在種植材料表面的黏附情況，直接影響到其增殖、分化以及在種植體-骨界面愈合中的作用。本實(shí)驗(yàn)通過吖啶橙染色，在熒光顯微鏡下觀察、比較血管內(nèi)皮細(xì)胞在兩種不銹鋼材料表面的黏附情況。其原理為：吖啶橙能與活細(xì)胞中雙螺旋DNA結(jié)合，形成發(fā)綠色熒光的復(fù)合物。在共培養(yǎng)1、2 d后，含銅不銹鋼組表面黏附的內(nèi)皮細(xì)胞多于316L不銹鋼組。Barbucci等[14]等研究表明：含有Cu2+的透明質(zhì)酸復(fù)合物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和黏附具有促進(jìn)作用。此外，MTT檢測(cè)結(jié)果也顯示，含銅不銹鋼組細(xì)胞的增殖活性高于316L不銹鋼組。分析原因可能是含銅不銹鋼富銅相中的銅以Cu2+形式溶出，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響[15]。

增殖和凋亡兩者的動(dòng)態(tài)平衡維持著組織的正常形態(tài)和功能。不同的合金材料由于成分、金相等差異，在析出金屬離子的種類上有所不同，對(duì)黏附其表面細(xì)胞的影響也各有差別[16]。Annexin V作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一，其原理為：細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylse-rine，PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V能與外側(cè)的PS特異性結(jié)合，標(biāo)記早期凋亡的細(xì)胞。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞早期凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，316L不銹鋼組的細(xì)胞凋亡率高于含銅不銹鋼組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。分析原因?yàn)椋簝煞N不銹鋼各自的組成成分不同，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡率之間存在差異。從而進(jìn)一步推測(cè)，含銅不銹鋼析出的Cu2+可能參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中的某一環(huán)節(jié)[17]。

本實(shí)驗(yàn)僅從細(xì)胞水平研究含銅不銹鋼對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、增殖及凋亡的影響，而析出的Cu2+與血管內(nèi)皮細(xì)胞的具體作用機(jī)制則有待于從分子水平進(jìn)一步探究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張揚(yáng). 正畸治療中支抗的控制與臨床應(yīng)用[J]. 中國(guó)實(shí)用口腔科

雜志， 2008， 1（4）：208-211.

Zhang Yang. Control of anchorage and its clinical application in

orthodontic treatment[J]. Chin J Pract Stomatol， 2008， 1（4）：208-

211.

[2] 吳晶， 白玉興， 王邦康， 等. 微型支抗種植釘愈合期骨結(jié)合狀態(tài)

的組織學(xué)觀察[J]. 北京口腔醫(yī)學(xué)， 2005， 13（4）：228-230.

Wu Jing， Bai Yuxing， Wang Bangkang， et al. Histological observa-

tion of osseointegration during mini-screw implant healing[J]. Bei-

jing J Stomatol， 2005， 13（4）：228-230.

[3] Hankenson KD， Dishowitz M， Gray C， et al. Angiogenesis in bone

regeneration[J]. Injury， 2011， 42（6）：556-561.

[4] Collin-Osdoby P， Nickols GA， Osdoby P. Bone cell function， regu-

lation， and communication： A role for nitric oxide[J]. J Cell Bio-

chem， 1995， 57（3）：399-408.

[5] Barron M， Franklin L， Woodall J Jr， et al. Comparison of osteo-

conductive materials on MG63 osteoblast cell function[J]. Biomed

Sci Instrum， 2007， 43：248-253.

[6] 薛楠， 張丹， 張揚(yáng)， 等. 抗菌不銹鋼材料的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)研究[J].

口腔醫(yī)學(xué)， 2010， 30（12）：712-715.

Xue Nan， Zhang Dan， Zhang Yang， et al. Cytotoxicity evaluation

of antibiotic stainless material[J]. Stomatology， 2010， 30（12）：712-

715.

[7] 楊偉超， 南黎， 李慧， 等. 含銅抗菌不銹鋼的抗菌性能研究[J]. 微

生物學(xué)雜志， 2009， 29（3）：1-5.

Yang Weichao， Nan Li， Li Hui， et al. Antibiotic properties of cop-

per containing antibiotic stainless steels[J]. J Microbiology， 2009，

29（3）：1-5.

[8] 胡赟， 鄭雷蕾， 唐甜， 等. 正畸微種植體周圍炎對(duì)骨結(jié)合界面影

響的研究[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2011， 29（1）：17-20， 26.

Hu Yun， Zheng Leilei， Tang Tian， et al. Influence of the peri-

implantitis to the microscrew-bone interface[J]. West China J Sto-

matol， 2011， 29（1）：17-20， 26.

[9] Franchi M， Fini M， Martini D， et al. Biological fixation of endos-

seous implants[J]. Micron， 2005， 36（7/8）：665-671.

[10] Collin-Osdoby P. Role of vascular endothelial cells in bone bio-

logy[J]. J Cell Biochem， 1994， 55（3）：304-309.

[11] Masi L， Brandi ML. Physiopathological basis of bone turnover[J].

Q J Nucl Med， 2001， 45（1）：2-6.

[12] Mentaverri R， Kamel S， Wattel A， et al. Regulation of bone re-

sorption and osteoclast survival by nitric oxide： Possible involve-

ment of NMDA-receptor[J]. J Cell Biochem， 2003， 88（6）：1145-

1156.

[13] MacIntyre I， Zaidi M， Alam AS， et al. Osteoclastic inhibition： An

action of nitric oxide not mediated by cyclic GMP[J]. Proc Natl

Acad Sci U S A， 1991， 88（7）：2936-2940.

[14] Barbucci R， Magnani A， Lamponi S， et al. Cu（Ⅱ） and Zn（Ⅱ）

complexes with hyaluronic acid and its sulphated derivative. Effect

on the motility of vascular endothelial cells[J]. J Inorg Biochem，

2000， 81（4）：229-237.

[15] 南黎， 劉永前， 呂曼祺， 等. 抗菌不銹鋼中的富銅析出相的殺菌

作用研究[J]. 世界鋼鐵， 2009（2）：49-51.

Nan Li， Liu Yongqian， Lü Manqi， et al. Study on killing bacteria

by cu-rich precipitates in an antibacterial stainless steel[J]. World

Iron Steel， 2009（2）：49-51.

[16] Schedle A， Samorapoompichit P， Rausch-Fan XH， et al. Response

of L-929 fibroblasts， human gingival fibroblasts， and human tissue

mast cells to various metal cations[J]. J Dent Res， 1995， 74（8）：

1513-1520.

[17] Harris AN， Hinojosa BR， Chavious MD， et al. Beyond platinum：

Synthesis， characterization， and in vitro toxicity of Cu（Ⅱ）-releasing

polymer nanoparticles for potential use as a drug delivery vector

[J]. Nanoscale Res Lett， 2011， 6：445.

（本文編輯 杜冰）