黏質(zhì)紅酵母的鑒定及鏈格孢菌抑菌機(jī)制的研究

蔡文韜 夏延斌 夏 菠 易有金 任佐華

CAIWen-tao XIA Yan-bin XIA Bo YIYou-jin REN Zuo-hua

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

(Hunan Agricultrue University,Changsha,Hunan 410128,China)

鏈格孢菌是茄科植株中危害較大的病害之一。該病不僅發(fā)生在田間，更是采后貯藏過(guò)程中的重要性病害，可侵染番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科類(lèi)果蔬[1，2]，侵害途徑主要是通過(guò)氣孔、皮孔、傷口或表皮侵入果實(shí)，在適宜條件下產(chǎn)生大量孢子，對(duì)果實(shí)造成嚴(yán)重危害[3]。目前主要采用化學(xué)法進(jìn)行防治，但是長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)造成環(huán)境污染，也會(huì)使得病原菌的抗藥性增強(qiáng)[4]，果蔬上殘留的農(nóng)藥也會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[5，6]。因此，利用生物法進(jìn)行果蔬采后病害防控，得到越來(lái)越多的關(guān)注。

植物內(nèi)生菌是一類(lèi)適宜在植物體內(nèi)生長(zhǎng)的微生物，一般具有較高的安全性，其中部分菌株具有潛在的抗病菌的能力[7]。近年來(lái)，利用植物內(nèi)生細(xì)菌防治植物土傳病的研究已取得較大進(jìn)展。但是對(duì)利用微生物進(jìn)行果蔬采后保鮮方面的研究甚少，且多數(shù)集中在細(xì)菌如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等生物防治方面，并取得了較好的成果。劉杰鳳等[8]從番茄、辣椒、茄子中分離出14株對(duì)青枯病有較強(qiáng)抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌；何紅[9]，邱思鑫[10]等報(bào)道了內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillus sp.)對(duì)辣椒疫霉引起的辣椒苗和果疫病有良好的防治效果；阿里馬斯等[11]報(bào)道了放線菌對(duì)辣椒疫霉菌和炭疽病防治效果，但是關(guān)于內(nèi)生真菌用于茄科鏈格孢菌的生防研究未見(jiàn)報(bào)道。另外由于這些微生物主要源于土壤、果蔬表面，易受外界因素的影響，導(dǎo)致防治效果不穩(wěn)定，極大地影響了拮抗菌的實(shí)用價(jià)值。因此植物內(nèi)生菌的活性物質(zhì)的提取及其環(huán)境穩(wěn)定性的研究在生物防治和果蔬采后處理已成為研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)從湖南省長(zhǎng)沙縣果蔬中心采集的柿子椒中篩選到了鏈格孢菌的拮抗真菌，通過(guò)16SrDNA序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，為黏質(zhì)酵母菌。用乙酸乙酯和無(wú)水乙醇對(duì)黏質(zhì)酵母菌發(fā)酵液抗菌物質(zhì)進(jìn)行提取，并進(jìn)行活性穩(wěn)定性測(cè)試和防腐應(yīng)用研究，以期為食品防腐尋求新的技術(shù)途徑，使內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物成為果蔬采后微生物抑制劑和作為天然殺菌劑具有廣泛應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)潛能。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

Strain-39菌：由本實(shí)驗(yàn)室從柿子椒果肉中分離得到；

鏈格孢菌：由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 Strain-39分子鑒定

參照文獻(xiàn)[12]、[13]進(jìn)行16SrDNA分子鑒定，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。得到的序列運(yùn)用Clust X軟件校準(zhǔn)排齊后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）同源性比對(duì)分析。以16SrDNA的序列同源性大于99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類(lèi)。然后在對(duì)待測(cè)菌株與模式菌株16SrDNA序列利用程序MEGA3.1中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)一步進(jìn)行種屬鑒定[14]。

1.3 拮抗菌strain-39的抑病活性檢測(cè)

辣椒和番茄用自來(lái)水反復(fù)清洗干凈，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒1～2min，然后用自來(lái)水沖洗掉殘余次氯酸鈉，晾干。用滅過(guò)菌的打孔器在番茄和辣椒各部位打一個(gè)直徑6mm深2 mm的洞，接種拮抗菌strain-39約106CFU/mL的培養(yǎng)濾液20μL，靜止5 min后，接種病原菌鏈格孢菌約106CFU/mL的菌液20μL，以不接種病原菌和接種病原菌的未浸泡拮抗菌的辣椒和番茄作為對(duì)照，28℃培養(yǎng)72 h，觀察果蔬是否出現(xiàn)病斑及感病的程度。

1.4 Strain-39菌液成分對(duì)鏈格孢菌抑菌測(cè)定方法

在PDA平板中心接直徑為5mm的鏈格孢菌菌餅，28℃培養(yǎng)3 d后，在離菌落邊緣2.5 cm處用口徑9mm的打孔器打4個(gè)孔，每孔分別加入200μL經(jīng)過(guò)處理菌液成分，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，待對(duì)照病原菌菌落長(zhǎng)到孔邊緣(6～7 d)后測(cè)量抑菌圈直徑。

(1)抑制率的計(jì)算：

(2)Strain-39菌液濾液制備的方法：將strain-39接種于PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜作為種子液，按1%接種量接種于液體培養(yǎng)基中（裝液量100 mL/250 mL錐形瓶中），28℃，180 r/min培養(yǎng) 7 d，用 10 000 r/min離心 15 min，紗布雙層過(guò)濾去菌絲，用0.22μm的過(guò)濾頭過(guò)濾得到發(fā)酵液。

(3)乙酸乙酯提取物的制備：發(fā)酵液用乙酸乙酯（1倍體積）萃取3次，重復(fù)3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮置干，用磷酸緩沖液溶解得乙酸乙酯提取液。

(4)75%乙醇沉淀物的提?。簩o(wú)水乙醇置于冰箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)冷處理，在抑菌物質(zhì)粗提液中緩慢加入乙醇使其在終濃度達(dá)到75%，于4℃靜置4 h以上，10 000 r/min，4℃離心20min，收集沉淀，即為粗提物，將所得蛋白溶于pH值為6.8的20mmol/L tris緩沖液中，所得沉淀即為75%乙醇沉淀粗提液。

1.5 菌液成分的抑菌機(jī)制

1.5.1 不同濃度菌液成分對(duì)鏈格孢菌抑菌效果 將strain-39菌液的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物按照半稀釋 法 配 成 一 系 列 質(zhì) 量 濃 度 梯 度（100，50，25，12.5，6.25mg/mL）的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物，75%乙醇沉淀粗提液用pH為6.8的20mmol/L tris緩沖液稀釋?zhuān)宜嵋阴ヌ崛∥镉昧姿峋彌_液稀釋?zhuān)赑DA平板中心接直徑為5mm的鏈格孢菌餅，25℃培養(yǎng)2～3 d后，在離菌落邊緣2.5 cm處用口徑9mm的打孔器打4個(gè)孔，每孔加200μL菌液成分，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，待對(duì)照快要長(zhǎng)滿全皿時(shí)，測(cè)量抑菌直徑，3次重復(fù)，計(jì)算毒理回歸方程、EC50值和95%置信區(qū)。

1.5.2 Strain-39菌液成分對(duì)果實(shí)病害的抑菌作用 菌液乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物分別用緩沖液稀釋到100mg/mL待用選取外觀整齊、飽滿圓潤(rùn)、無(wú)損傷的新鮮辣椒和番茄，用自來(lái)水清洗后在0.1%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒3min，再用自來(lái)水反復(fù)沖洗至殘余次氯酸鈉洗掉，晾干。用無(wú)菌的打孔器在番茄和辣椒的部位各打一個(gè)直徑6 mm深2mm的洞，注入20μL菌液成分，靜置2 h后，立即在傷口處加入20μL鏈格孢菌孢子懸浮液，以保鮮液和無(wú)菌水作為對(duì)照。用保鮮袋密封，以保持濕度，將蔬菜置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)貯藏，7 d后計(jì)算爛果率，每個(gè)處理分3組。每組隨機(jī)挑選60個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5.3 Strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液以及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌菌絲形態(tài)影響 鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h活化，移接菌蝶5片于濃度為10%的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液中，以加相同量的不含菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，培養(yǎng)48 h后在光學(xué)顯微鏡觀察病原菌菌絲形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.4 75%乙醇沉淀粗提液及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響 將鏈格孢菌接種在PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)10 d，然后加入一定量的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液沖洗斜面上的孢子，經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲殘?bào)w，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液稀釋至孢子濃度為106個(gè)/mL。每個(gè)視野60個(gè)孢子（10倍放大），取20μL滴加在凹玻片上，將凹玻片放在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)先放入10 mL無(wú)菌水，在無(wú)菌水上平放一張滅菌濾紙。再滴加20μL 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液?；靹蚝笾糜?8℃下培養(yǎng)12 h，以無(wú)菌水處理為對(duì)照，并按式(2)計(jì)算拮抗菌的抑制率，每處理3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.5.5 胞外蛋白以及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響 鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，然后將菌蝶接種于PDA培養(yǎng)基中央，待菌落直徑達(dá)3 cm時(shí)，將周?chē)囵B(yǎng)基挖出，將75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物分別用磷酸緩沖液稀釋2倍和10倍，分別取20mL淹沒(méi)真菌菌落20min，傾去緩沖稀釋液，每處理3次重復(fù)，以無(wú)菌水處理為空白對(duì)照，置于28℃下培養(yǎng)6 d，至孢子產(chǎn)生，每平板用10mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液將孢子洗下，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，得孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.5.6 不同溫度處理對(duì)75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 將75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液2mL裝于試管中，在50，75，100℃條件下處理20min（恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行），121℃（高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行）處理20min，以未進(jìn)行溫度處理的各樣品作為對(duì)照，測(cè)定抑菌活性，每處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.5.7 pH對(duì)75%乙醇沉淀提取液和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 調(diào)節(jié)50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）的pH值分別為 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，將 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物與不同的緩沖液等體積混合，置于4℃的冰箱內(nèi)保存24 h，再用2 mol/L的鹽酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至原菌液成分酸堿度（7.0左右），用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。以鏈格孢菌為指示菌，測(cè)定抑菌活性，未經(jīng)過(guò)處理的各樣品作為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.5.8 紫外線處理對(duì)75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 取1 mL 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液置于60W紫外燈下30 cm照射1 h，以未經(jīng)處理的各樣品成分為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.5.9 數(shù)據(jù)分析 用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05判斷差異有顯著性，P<0.01判斷差異極顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體和菌落特征

圖1 菌株strain-39的16SrDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR results of 16SrDNA sequences from the isolated srains-39

圖2 基于16SrDNA序列的菌株strain-39系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequence analysis of strain-39

通過(guò)稀釋洗液涂布平板后可以形成單獨(dú)的菌落，這些內(nèi)生拮抗真菌的菌落形態(tài)相似，邊緣整齊，不著色，表面光滑，稍濕潤(rùn)，無(wú)光澤，菌體橢圓形，橘紅色，取其中一個(gè)菌落，復(fù)紅簡(jiǎn)單染色后，置普通光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體為革蘭氏陽(yáng)性。提取菌株strain-39基因組DNA，以?xún)?nèi)生菌株strain-39基因組DNA為模板，按1.2中的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1），對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序得到strain-39的16SrDNA長(zhǎng)度為539 bp。利用Blast軟件，將菌株的16SrDNA序列與GenBank中數(shù)據(jù)庫(kù)已知的16SrDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，真菌strain-39的 16SrDNA 序列（539 bp）與（Uncultured basidiomycota genomic DNA）的序列相同。用軟件MEGA3.1按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）相似性都達(dá)到100%，結(jié)合strain-39形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化指標(biāo)測(cè)定等表型鑒定結(jié)果，strain-39菌株鑒定為黏質(zhì)紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。

2.2 拮抗菌strain-39的抑病活性檢測(cè)

由圖3可知，僅接種鏈格孢菌，不接種內(nèi)生菌的辣椒和番茄上出現(xiàn)明顯的鏈格孢菌病斑，而接種內(nèi)生菌的辣椒和番茄上，鏈格孢菌產(chǎn)生的病斑較小。說(shuō)明菌株stain-39發(fā)酵液能夠較好的降低鏈格孢菌的致病力。

圖3 黏質(zhì)紅酵母strain-39對(duì)鏈格孢菌的抑菌活性試驗(yàn)Figure 3 Detection of inhibitory activity of strain-39 against pathogen A.alternate

2.3 菌液75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌體外抑菌效果

對(duì)菌株strain-39 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，由圖4和表1可知，75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物稀釋不同濃度處理對(duì)鏈格孢菌都有較好的抑菌效果，strain-39菌液乙醇沉淀粗提液質(zhì)量濃度梯度為 100，50，25，12.5，6.25mg/mL 時(shí)對(duì)鏈格孢菌的抑制率分別為85.45%，80%，54.55%，43.64%，28.88%。乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度梯度為 100，50，25，12.5，6.25mg/mL 時(shí)對(duì)鏈格孢菌抑制率分別為 86.85%，81.97%，72.13%，45.90%，35.87%，其中75%乙醇沉淀提取液的EC50為16.353 1 mg/L，而乙酸乙酯提取物的EC50為11.800 3mg/L，后者抑菌效果較前者高。

2.4 Strain-39菌液成分對(duì)果實(shí)病害的抑菌作用

由圖5可知，通過(guò)損傷接種，strain-39的菌液成分對(duì)茄科植物辣椒和番茄果肉都具有明顯的抑菌作用，在一定質(zhì)量濃度下均能降低辣椒和番茄的爛果率，乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí)，辣椒的爛果率與無(wú)菌水相比下降了51.879%，番茄的爛果率與無(wú)菌水相比下降了58.47%，75%乙醇沉淀粗提液的腐爛率與無(wú)菌水相比辣椒的爛果率下降了47.5%，番茄的爛果率與無(wú)菌水相比下降了50.47%，不同菌液成分相比，乙酸乙酯提取物比75%乙醇沉淀粗提液的抑菌效果較好，與體外抑菌效果一致。與體外抑制作用效果相比，體內(nèi)抑制作用的效果顯然有所降低，但直接證明了strain-39抑菌成分對(duì)果實(shí)病害的抑制作用。

2.5 Strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液以及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌菌絲形態(tài)的影響

圖4 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌抑菌效果Figure 4 Effecton A.alternata by 75%ethanol sediment liquid and ethyl acetate extract produced from strain-39

表1 菌株strain-39不同菌液成分對(duì)鏈格孢菌的抑制作用Table1 Inhibition effects of extraction from strain-39 against A.alternate

由圖6和7可知，strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢病菌菌絲的形態(tài)均有影響，將鏈格孢菌與strain-39 75%乙醇沉淀提取液和乙酸乙酯提取物在PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng)6 d后，產(chǎn)生明顯的抑菌帶，靠近菌液成分邊緣處的病菌不能正常向外擴(kuò)展，而且此處菌絲變成褐色，說(shuō)明其活性物質(zhì)可抑制鏈格孢菌的生長(zhǎng)，調(diào)取邊緣菌絲在顯微鏡下觀察，活性成分邊緣的鏈格孢菌的菌絲頂端及中間形成大量泡狀體，以致整個(gè)菌絲變成串珠狀，菌絲體分枝增多、畸形。且乙酸乙酯提取物處理的部分菌絲呈現(xiàn)原生質(zhì)顆?；?，而正常生長(zhǎng)的菌絲成細(xì)長(zhǎng)狀，且整個(gè)菌絲均勻透明。

2.6 Strain-39 75%乙醇沉淀粗提液及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，strain-39的75%乙醇沉淀粗提液處理后抑制鏈格孢菌分生孢子的萌發(fā)率為7.45%，而以無(wú)菌水處理的對(duì)照處理組分生孢子萌發(fā)率為75.36%；乙酸乙酯提取物處理過(guò)的孢子萌發(fā)率為9.6%，對(duì)照組為73.65%。由此說(shuō)明，strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子的萌發(fā)都具有較好抑制作用。

圖5 Strain-39菌液成分對(duì)辣椒、番茄的抑制效果的影響Figure 5 Inhibitory effectof extraction from strain-39 on diseases of peppers and tomatoes

圖6 Strain-39 75%乙醇沉淀提取液處理鏈格孢菌菌絲的形態(tài)Figure 6 Effectonmorphology by 75%ethanol sediment liquid produced from strain-39

圖7 Strain-39乙酸乙酯提取物處理鏈格孢菌菌絲的形態(tài)Figure 7 Effectonmorphology by ethyl acetate extract produced from strain-39

表2 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提物和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響Table2 Effecton germination of conidiospore of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39

2.7 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提液以及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響

將PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至3 cm的鏈格孢菌菌塊分別加入稀釋2倍、10倍濃度的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液20mL，浸沒(méi)菌落20min后去除液體，以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，6 d后計(jì)算孢子萌發(fā)率，結(jié)果見(jiàn)表3。不同稀釋倍數(shù)的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液均對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生顯著性抑制作用，隨其稀釋倍數(shù)的增加，抑制作用也逐漸減弱，與對(duì)照相比，75%乙醇沉淀粗提液稀釋2倍鏈格孢菌孢子數(shù)為0.106×106個(gè)，其抑制率達(dá)到84.7%，稀釋10倍其孢子數(shù)為0.253×106個(gè)，孢子抑制率達(dá)到63.49%。而乙酸乙酯提取物稀釋2倍對(duì)孢子抑菌率為66.42%，稀釋10倍抑制率為71.87%，說(shuō)明strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物可較好地抑制鏈格孢菌的產(chǎn)孢。

表3 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響Table3 Effect on production of conidium of A.alternata by 75%ethanol sediment and ethyl acetate extract produced from strain-39（/×106 CELLS·mL-1）

表3 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響Table3 Effect on production of conidium of A.alternata by 75%ethanol sediment and ethyl acetate extract produced from strain-39（/×106 CELLS·mL-1）

同列不同行大寫(xiě)字母不同代表差異顯著，P<0.05。

提取液稀釋倍數(shù)2 10 CK乙酸乙酯提取物0.346B 0.413B 1.230A 75%乙醇沉淀提取液0.106A 0.253B 0.693B

2.8 不同溫度處理對(duì)strain-39 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物液抑菌活性的影響

表4 不同溫度處理下strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table4 Effecton growth of of A.alternate by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different temperature

表4 不同溫度處理下strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table4 Effecton growth of of A.alternate by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different temperature

同列不同行大寫(xiě)字母不相同代表差異顯著，P<0.05。

溫度/℃75%乙醇沉淀提取物 乙酸乙酯提取物菌落直徑/mm 抑制率/% 菌落直徑/mm 抑制率/%50 75 100 121 CK 47.65±1.09A 45.36±2.33A 47.42±1.98A 18.56±1.63B—20.4 20.2 22.27 25 35.13 40.35±1.81A 42.52±1.08A 35.94±2.84B 28.92±1.23C—17.77 18.53 17.83 27.63 33.93

取strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物，不同溫度處理后測(cè)定其抑制率。由表4可知，75%乙醇沉淀粗提液在50℃和120℃，隨著溫度的增加抑菌活性逐漸降低（P<0.05），乙酸乙酯提取物在50～100℃時(shí)無(wú)顯著性差異（P<0.05），在121℃時(shí)，抑菌效果明顯降低（P<0.05）。兩者活性成分在不同溫度處理下抑菌活性不同，說(shuō)明Strain-39中抑菌活性物質(zhì)可能含有幾種，且總體抑菌效果受溫度影響不大。即使120℃高溫處理下，菌液成分仍保持部分抑菌活性。

2.9 pH對(duì)strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物的抑菌活性影響

由表5可知，pH在2～12對(duì)不同成分均有抑菌活性，strain-39的75%乙醇沉淀提取液最適pH為4～6，且抑菌活性達(dá)到52.66%，抑菌活性隨著pH的增加而增加，無(wú)顯著性差異（P<0.05），說(shuō)明pH在酸性條件下活性比較穩(wěn)定，在堿性條件下隨著pH的增加活性逐漸降低，pH 12時(shí)活性顯著性降低（P<0.05），而乙酸乙酯提取物最適pH為6～8，在 pH 6時(shí)，抑菌活性達(dá)到38.97%，與75%乙醇沉淀提取物處理液相比，活性較穩(wěn)定。在pH 2和pH 10條件下，仍具有活性。說(shuō)明菌液成分活性物質(zhì)具有較高酸堿穩(wěn)定性。

表5 不同pH處理下strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table5 Effect on the growth of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different pH

表5 不同pH處理下strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table5 Effect on the growth of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different pH

同列不同行大寫(xiě)字母不同代表差異顯著，P<0.05。

pH 75%乙醇沉淀提取物 乙酸乙酯提取物菌落直徑/mm 抑制率% 菌落直徑/mm 抑制率/%2 4 6 8 1 0 12 CK 27.74±2.39C 21.59±1.48C 38.97±4.81A 31.12±3.24B 31.48±0.74B 21.41±3.60C—20.87 16.70 15.57 22.03 26.46 30.07 32.90 36.44±3.59A 49.14±2.68A 52.66±1.93A 33.01±1.58B 19.41±4.07C 8.53±1.98D—24.93 27.06 21.03 23.80 23.67 27.13 34.53

2.10 紫外線處理對(duì)strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響

表6 Strain-3975%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物在紫外處理下對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table6 Effecton the growth of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under UV

同列不同行大寫(xiě)字母不同代表差異顯著，P<0.05。

紫外處理/min 75%乙醇沉淀提取物 乙酸乙酯提取物菌落直徑/mm 抑菌率% 菌落直徑/mm 抑制率/%30 60 90 CK 20.23 23.23 24.77 37.07 45.32±4.35A 37.25±2.75B 33.23±2.06B—23.87 28.54 31.7 37.7 41.02±6.35A 24.32±1.49B 15.89±1.44B—

由表6可知，在紫外照射下菌液不同成分都具有一定的抑菌活性，在紫外下照射30min，strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物的抑菌效果最高，隨著紫外照射的時(shí)間延長(zhǎng)乙酸乙酯提取物的抑菌活性顯著性降低（P<0.05），在90min時(shí)抑菌效果最弱，而75%乙醇沉淀提取物在處理90min后抑菌活性無(wú)顯著變化。整體來(lái)說(shuō)不同菌液成分經(jīng)紫外處理后仍保持一定的抑菌活性。

3 討論

本試驗(yàn)從新鮮辣椒果肉內(nèi)篩選出一株對(duì)茄科鏈格孢菌具有抑菌效果的內(nèi)生拮抗菌，通過(guò)16SrDNA鑒定為黏質(zhì)紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa），該菌株能夠明顯降低鏈格孢菌的致病力，具有成為果蔬采后鏈格孢菌抑制劑和作為天然殺菌劑的廣泛應(yīng)用前景。

對(duì)該菌株的菌液成分75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物抑菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物均具有良好的抗菌活性。strain-39在鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)和發(fā)育、孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)等都具有抑制作用，表明拮抗菌strain-39有效抑制了鏈格孢菌的生長(zhǎng)、繁殖等各個(gè)環(huán)節(jié)，且對(duì)鏈格孢菌侵染循環(huán)的抑制是各個(gè)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果，具有廣泛的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

防腐保鮮試驗(yàn)結(jié)果顯示strain-39菌液成分對(duì)抵御病原真菌的侵入，減少腐爛率，在防腐保鮮方面起到了重要作用，鏈格孢菌是茄科植物常見(jiàn)的病原菌，因此考慮將其替代化學(xué)殺菌劑用于果蔬采后保鮮方面，有望為食品防腐尋求新的技術(shù)途徑。

Strain-39分泌的抗菌物質(zhì)主要為低分子量抗菌素和胞外蛋白[14，15]。菌株strain-39 75%沉淀提取物在高溫處理后對(duì)鏈格孢菌抑制效果逐漸降低，但不是很明顯，是否為抑菌蛋白有待進(jìn)一步研究。而乙酸乙酯提取物在121℃時(shí)抑菌活性明顯下降，說(shuō)明strain-39對(duì)鏈格孢菌的抑菌作用是為多種活性物質(zhì)作用的共同結(jié)果，后期還將進(jìn)一步分離純化strain-39菌株代謝物的抑菌活性成分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，進(jìn)而對(duì)所分離出的各組分的抑菌活性和相互作用做更深入的研究。

1 鄒鳳蓮,汪志平,盧鋼.番紅花鏈格孢菌的分離及其生物學(xué)特性研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào),2006,32(2):162～167.

2 馮源,祖艷群,陳海燕,等.UV－B輻射增強(qiáng)對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)、生理及致病力的影響[J].植物學(xué)報(bào),2010,36(4):64～69.

3 趙亞蘭,朱圣潔,任素櫻.番茄早疫病的綜合防治[J].河套大學(xué)學(xué)報(bào),2010,7(4):23～25.

4 Sharma R R,Singh D,Singh R.Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists:A review[J].Biol.Control,2009,50（3）:205～221.

5 Korsten L.Advances in control of postharvest diseases in tropical fresh produce[J].International Journal of Postharvest Technology and Innovation,2006,1(1):48～61.

6 Mann A,Yahaya Y,Banso A,et al.Phytochemical and antibacterialscreening of anogeissus leiocarpus against somemicroorganisms associated with infectious wounds[J].African Journal of Microbiology Research,2008,2(3):60～62.

7 劉杰鳳,韓寒冰,張進(jìn)鳳,等.茄類(lèi)內(nèi)生菌的分離及生防功能初探[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(3):1 160～1 162.

8 何紅,蔡血清,陳玉森,等.辣椒內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS-2和BS-1防治香蕉炭疽病研究[J].福建農(nóng)林學(xué)報(bào),2002,31(4):441～443.

9 邱思鑫,何紅,阮宏椿.內(nèi)生芽孢桿菌TB2防治辣椒疫病效果及其機(jī)理初探[J].植物病理學(xué)報(bào),2004,34(2):173～179.

10 張曉鹿.辣椒疫病生防真菌與放線菌混合接種的防病促生效應(yīng)研究[D].陜西：西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.

11 別小妹,陸兆新,房耀維,等.利用16SrDNA序列分析鑒定一株抗菌物質(zhì)的微生物菌株[J].食品科學(xué),2006,27(11):466～470.

12 孔維嘉，王洋，尚楠，等.擴(kuò)展青霉拮抗菌的篩選鑒定及抗菌物質(zhì)分析[J].食品科學(xué)，2011,32(15):153～156.

13 東秀珠.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) [M].北京:科學(xué)出版社,2001:62～64.

14 Mcinroy J A,Kleopper JW.Population dynamics of endophytic bacteria in field-grown sweet corn and cotton[J].Can J.Microbiol.,1995(41):895～901.

15 劉偉成，盧彩鴿，劉學(xué)敏，等.利迪鏈霉菌A02抗真菌活性產(chǎn)物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定[J].生物工程學(xué)報(bào)，2009,25(6):840～846.