生物法制備低過(guò)敏乳的研究進(jìn)展

葉笑艷 錢(qián) 方 孫 洋 牟光慶 姜淑娟

YE Xiao-yan1 QIAN Fang1 SUN Yang2 HMU Guang-qing1 JIANG Shu-juan1

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

(1.School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034,China;2.School of Information Science and Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034,China)

牛乳是人類最主要的乳資源，營(yíng)養(yǎng)豐富，幾乎含有人體所有的必需氨基酸。在發(fā)達(dá)國(guó)家乳蛋白及其制品提供了20%～30%的食物蛋白，顯示了乳蛋白廣泛的應(yīng)用前景。然而，牛乳亦給過(guò)敏體質(zhì)的特殊人群帶來(lái)麻煩[1]。0.5%～7.5%的兒童和約1%的成年人發(fā)生牛乳過(guò)敏現(xiàn)象，嚴(yán)重影響人體健康，在全球范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注[2]。制備低過(guò)敏乳不僅可以擴(kuò)大牛乳的食用人群，而且為乳制品的多樣化生產(chǎn)提供原料。一般來(lái)說(shuō)，引起食物過(guò)敏的過(guò)敏原大都來(lái)源于食物蛋白，而實(shí)際上與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的僅為其部分抗原決定基（數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)氨基酸），即“表位”（epitope）。乳蛋白過(guò)敏表位分為連續(xù)性過(guò)敏表位（線性表位）和不連續(xù)性過(guò)敏原表位（構(gòu)象表位）。線性表位是由某些氨基酸殘基按一定順序連續(xù)排列組成的線狀序列，屬于蛋白分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)；構(gòu)象表位是由分子內(nèi)不連續(xù)的氨基酸殘基組成，屬于蛋白分子的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)[3,4]。線性表位的活性依賴于氨基酸序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)，構(gòu)象表位的活性依賴于構(gòu)象。因此如何破壞或去除過(guò)敏表位就成為開(kāi)發(fā)低過(guò)敏食品的關(guān)鍵所在[5]。

1 牛乳主要過(guò)敏蛋白組成

美國(guó)乳品科學(xué)協(xié)會(huì)委員會(huì)基于牛乳蛋白的氨基酸序列，將其分為酪蛋白和乳清蛋白。酪蛋白（casein)主要含α-酪蛋白、γ-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白；乳清蛋白（whey protein)主要含 α-乳白蛋白（α-LA)、β-乳球蛋白（β-LG)、血清白蛋白（BSA)、免疫球蛋白（LGS)等[6]。絕大多數(shù)的牛乳蛋白都潛在過(guò)敏性，目前普遍認(rèn)為casein、β-LG及α-LA是主要過(guò)敏原，BSA、LGS是次要過(guò)敏原。牛乳中β-LG占乳清蛋白50%，而人乳中不含β-LG[7]。因此該蛋白被認(rèn)為是牛乳中最主要的過(guò)敏原之一[8]。

β-LG分子量為18 kDa左右，等電點(diǎn)為5.3，由162個(gè)氨基酸殘基組成[9]。其中包括5個(gè)半胱氨酸（Cys)殘基和2個(gè)酪氨酸（Try)殘基（Trp19和Trp61)[10]，半胱氨酸中的4個(gè)殘基形成了二硫鍵（Cys106-Cys119、Cys66-Cys160)，而另1個(gè)巰基在蛋白質(zhì)的121位置上。牛乳中β-LG以非共價(jià)鍵連接成二聚體，并通過(guò)氫鍵達(dá)到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[11]。

β-LG屬于強(qiáng)過(guò)敏原脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（lipocalin)家族。lipocalin蛋白結(jié)構(gòu)上的重要特征就是在其N(xiāo)-端有不易被破壞的相似序列，19位總是色氨酸。且具有相同由重復(fù)排列的8或 10個(gè)反向平行的 β-片層組成（A、B、C、D、E、F、G、H、I)及β-桶狀結(jié)構(gòu)（A和H之間閉合結(jié)構(gòu))（圖1)[12]。其中，β-LG的41～60、102～124、149～162 表位可被 90%～100%牛乳過(guò)敏患者血清識(shí)別，被稱為主要過(guò)敏表位。另有 1～8、25～40、92～100 表位，可被58%～72%過(guò)敏患者血清識(shí)別[13,14]。有研究[15]報(bào)道，β-LG耐胃酸、耐胃蛋白酶水解，即使通過(guò)胃腸道仍保持完整的β-LG或致敏肽段，仍具有致敏性。

圖1 牛乳中β-LG的三維結(jié)構(gòu)Figure 1 Three-dimensional structure ofβ-LG inmilk

2 降低牛乳蛋白過(guò)敏性的方法

牛乳蛋白過(guò)敏性的降低主要是用物理法（熱、射線、機(jī)械震蕩等）、化學(xué)法（化學(xué)試劑）、生物法（酶法水解、發(fā)酵）等破壞蛋白質(zhì)的過(guò)敏表位[16]。

物理法中熱處理是食品加工最常用的一種方式。熱處理可使蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生共價(jià)或非共價(jià)的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間構(gòu)象或三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，所產(chǎn)生的聚合物在一定程度上可掩蓋其過(guò)敏表位，從而降低其過(guò)敏性[17]。熱處理方式很多，如烘烤、蒸煮、煎炸等，對(duì)蛋白的過(guò)敏性產(chǎn)生不同影響。

化學(xué)法中糖基化在降低牛乳蛋白過(guò)敏性中得到廣泛應(yīng)用[18]，是通過(guò)蛋白質(zhì)和糖類之間的美拉德反應(yīng)，使乳蛋白生成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖基化合物，乳蛋白中過(guò)敏線性表位和構(gòu)象表位結(jié)構(gòu)被破壞，從而降低蛋白過(guò)敏性。最常用也是研究最多的是聚乙烯乙二醇及其衍生物(PEGs）和羧甲基葡聚糖(CMD）[19]。

目前，生物法制備低過(guò)敏乳常用酶法水解和乳酸菌發(fā)酵兩種方法[20]。酶法水解反應(yīng)條件溫和，不會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)損失，也不會(huì)產(chǎn)生毒理方面問(wèn)題。此外，還具有時(shí)間短、酶解程度可控制，在低酶濃度下即產(chǎn)生顯著效果等優(yōu)點(diǎn)[21]。乳酸菌發(fā)酵不僅可以改善牛乳風(fēng)味，在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生新的功能水解物，是降低牛乳過(guò)敏的有效技術(shù)[22]。

3 生物法制備低過(guò)敏乳

3.1 酶法水解制備低過(guò)敏乳

酶法水解是利用一種或多種蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行限制性水解，產(chǎn)生小分子肽和氨基酸。按照酶解程度不同，可分為輕度酶解、適度酶解和深度酶解。輕度酶解和適度酶解被認(rèn)為是限制性酶解，可實(shí)現(xiàn)水解度和酶解產(chǎn)物多樣化的調(diào)控，主要用于生產(chǎn)功能性蛋白或生理活性肽；深度酶解產(chǎn)物主要是小肽和氨基酸，主要用于調(diào)味品和營(yíng)養(yǎng)配方[23]。不同程度酶法水解產(chǎn)物的過(guò)敏性得到不同程度的降低，近年來(lái)輕度酶解在開(kāi)發(fā)低過(guò)敏食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

傳統(tǒng)的食品加工方法（如物理法）對(duì)乳蛋白構(gòu)象表位破壞程度較大，而酶法水解對(duì)其線性表位破壞程度較大。酶法水解對(duì)過(guò)敏乳蛋白的作用主要有兩方面：①肽鍵斷裂，過(guò)敏線性表位減少，從而降低過(guò)敏性；②改變抗原決定簇的三級(jí)結(jié)構(gòu)，即過(guò)敏構(gòu)象表位減少，使過(guò)敏蛋白失去活性，降低過(guò)敏性[24]。不同程度酶法水解的嬰幼兒配方乳粉已上市，雖降低了乳的過(guò)敏性，但并未完全消除，對(duì)極少數(shù)人群仍存在過(guò)敏性。酶解過(guò)程中酶的種類、酶解方式、酶解程度等因素對(duì)乳蛋白過(guò)敏性的降低起著重要作用。

酶的選擇是酶法水解的關(guān)鍵，由于乳蛋白過(guò)敏原表位的廣泛存在，選酶具一定盲目性。酶解牛乳過(guò)敏蛋白的常用酶有：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶等[25]。比如，β-LG主要過(guò)敏線性表位 41～60、102～124、149～162 的氨基酸序列與胰蛋白酶（酶切位點(diǎn)：Arg、Lys的 C 端）、木瓜蛋白酶 (酶切位點(diǎn)：Gly、Val、Leu、Arg、Lys、Phe等的 C 端)和中性蛋白酶（酶切位點(diǎn)：Leu、Ile、Phe的C端）的酶切位點(diǎn)吻合。因此，這3種酶均可水解破壞β-乳球蛋白的主要過(guò)敏表位，得到低過(guò)敏產(chǎn)物。

酶解前通過(guò)熱處理使蛋白質(zhì)變性是非常重要的，熱處理后牛乳蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)展開(kāi)，對(duì)蛋白酶更加敏感[26]。Kim等[27]用胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶體系50℃下分別水解天然的和熱處理（100℃，10min）的2%濃縮乳清蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著酶量的增加，兩者的抗原性均降低。與天然濃縮乳清蛋白相比，熱處理的濃縮乳清蛋白抗原性更低。Lametti等[28]用胰蛋白酶或胰凝乳酶分別在55，60，65℃，中性條件下水解牛乳β-LG，從蛋白的結(jié)構(gòu)變化上闡明，蛋白酶解使多數(shù)引起抗原性因子的過(guò)敏表位減少甚至消失，最終導(dǎo)致水解產(chǎn)物的低過(guò)敏性。

張潔等[29]用胰蛋白酶水解乳蛋白發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水解度為4%～10%時(shí)，乳蛋白水解物的抗原性明顯降低且變化程度較小。因此，從經(jīng)濟(jì)角度考慮以水解度達(dá)到4%為指標(biāo)，優(yōu)化胰蛋白酶水解條件，得到的輕度酶解產(chǎn)物作為嬰兒配方食品的原料，可降低嬰兒過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。Martinez等[30]用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解牛乳蛋白，將乳清蛋白和酪蛋白按照人乳比例配比，控制蛋白濃度為 4%～6%，在 pH≥6.6，30～50 ℃，2～6 h下控制水解度在4%～10%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著酶解進(jìn)行，乳蛋白過(guò)敏表位被破壞并生成小分子肽，其抗原性降低約90%。

3.2 發(fā)酵法制備低過(guò)敏乳

牛乳經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，其過(guò)敏性會(huì)大大降低甚至消失。一種可能性是發(fā)酵乳的有效成分進(jìn)入機(jī)體后，調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞（helper T cell,Th）中Th1和Th2免疫反應(yīng)之間的平衡，從而防止過(guò)敏發(fā)生。Matsuzaki等[31]研究發(fā)現(xiàn)，牛乳過(guò)敏可能是由于Th1與Th2免疫反應(yīng)的不平衡所引起的?？诜衫胰闂U菌發(fā)酵乳可抑制機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白（IgE），刺激機(jī)體產(chǎn)生自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），從而調(diào)節(jié)機(jī)體Th1和Th2免疫反應(yīng)的平衡，達(dá)到防止過(guò)敏的目的。

牛乳發(fā)酵降低過(guò)敏性的另一種可能機(jī)制是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生蛋白酶，進(jìn)而水解乳蛋白過(guò)敏表位[32]。針對(duì)這種機(jī)制的相關(guān)研究較多。

乳酸菌水解蛋白質(zhì)的能力差異很大，主要與菌體內(nèi)蛋白酶活性有關(guān)。存在于細(xì)胞表面的蛋白酶把蛋白質(zhì)切斷至肽，然后滲入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶分解成氨基酸。一般來(lái)說(shuō)乳桿菌的酶活性比球菌高。研究[33]發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌中呈現(xiàn)一種廣泛的肽酶活性，不僅包括肽鏈外切酶還有肽鏈內(nèi)切酶。由此可知，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶和肽酶進(jìn)行乳蛋白水解，破壞乳蛋白的過(guò)敏位點(diǎn)可在一定程度上降低牛乳的抗原性。

Kleber等[34]篩選乳酸菌以降低脫脂牛乳和甜乳清的抗原反應(yīng)，通過(guò)ELISA反應(yīng)量化β-LG的抗原活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乳酸菌發(fā)酵法能有效地降低牛乳抗原活性。篩選菌株使兩種原料中β-LG抗原性分別降低70%和90%，這不僅是因?yàn)榕Ｈ榈某煞植煌?，更重要的是不同乳酸菌釋放的蛋白酶種類和活性各有差異。

Haddad等[35]發(fā)現(xiàn)牛乳經(jīng)90～95℃熱處理10～15 min后，β-LG與酪蛋白微粒結(jié)合，再經(jīng)嗜溫和嗜熱乳酸菌或混合菌種37℃發(fā)酵，酸乳抗原性比鮮乳降低了99%以上。故熱處理和乳酸菌發(fā)酵相結(jié)合，降低牛乳蛋白抗原性的能力更強(qiáng)。

4 結(jié)論

牛乳是人類不可或缺的食品，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值一直被大家所重視，同時(shí)，牛乳及乳制品又是主要過(guò)敏食品之一[36]。與傳統(tǒng)的物理法和化學(xué)法降低牛乳過(guò)敏性相比，生物法在降低其過(guò)敏性的同時(shí)，還可改變牛乳本身的風(fēng)味。乳酸菌分解乳糖產(chǎn)生乳酸，及丙酮酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)（乙酸、乙醇、丁二酮和乙醛）等賦予食品典型的香味，應(yīng)用前景更廣[37]。經(jīng)生物法處理的牛乳，其抗原性有很大程度下降，但卻不能完全消除，這仍舊限制著乳制品的食用人群。因此，研究工作者仍致力于牛乳過(guò)敏的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，為生產(chǎn)出安全、無(wú)過(guò)敏的乳制品提供理論和技術(shù)支持。

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