人皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定＊

吳艷紅 鄧安彥 李曉紅 曾文光 左鳳瓊

（1.四川省人民醫(yī)院輸血科，四川 成都 610072；2.南充市中心醫(yī)院輸血科，四川 南充 637000；3.四川大學(xué)華西藥學(xué)院生化教研室，四川 成都 610041；4.遂寧市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 遂寧 629000；5.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

成纖維細(xì)胞（Fibroblasts，F(xiàn)bs）是皮膚真皮網(wǎng)織層中最重要的細(xì)胞，主要存在于疏松結(jié)締組織中，能合成和分泌大量膠原蛋白，對(duì)維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用［1］。在皮膚的燒傷、撕脫傷等創(chuàng)傷均會(huì)造成不同程度的細(xì)胞變性、壞死，需要通過(guò)細(xì)胞增生和細(xì)胞間基質(zhì)的形成來(lái)進(jìn)行組織修復(fù)。在衰老或損傷的皮膚修復(fù)過(guò)程中加入自體和／或異體的成纖維細(xì)胞，可以使構(gòu)建的真皮具有更有細(xì)胞活性，更能迅速促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移和增殖，從而快速修復(fù)衰老、損傷部位，使皮膚變年輕或創(chuàng)傷迅速愈合。真皮的構(gòu)建所需要的種子細(xì)胞－成纖維細(xì)胞在體外分離培養(yǎng)后，隨著傳代次數(shù)的增加增殖能力逐漸下降，因此建立一種穩(wěn)定的、高效的成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 臨床無(wú)菌切除幼兒包皮。

1.1.2 試劑及抗體

高糖－DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自成都哈里公司；小牛血清購(gòu)自Gibco公司；25cm2塑料培養(yǎng)瓶購(gòu)自Thermfisher公司；胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶均購(gòu)自Sigma公司。兔抗波形蛋白（Vmientin）抗體購(gòu)自博士德公司；余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)

取臨床無(wú)菌切除幼兒包皮，于超凈工作臺(tái)上用含青霉素100U·ml－1、鏈霉素100U·ml－1的PBS充分洗滌，D－h(huán)anks清洗一次，剔除皮下組織后用無(wú)菌眼科剪將皮膚標(biāo)本剪成小塊，放置于Ⅱ型膠原酶消化液中4℃消化過(guò)夜，24h后于超凈臺(tái)中無(wú)菌分離表皮和真皮。棄表皮，將真皮剪碎，然后轉(zhuǎn)移至0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）中約15min，以含10%小牛血清的高糖－DMEM培養(yǎng)液終止消化，2000r·min－1離心5min，將沉淀物接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶，加約4ml含10%小牛血清的高糖－DMEM培養(yǎng)液，注意勿使組織浮起，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，次日補(bǔ)加培養(yǎng)液5ml。原代細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%以上即可傳代，傳代時(shí)用0.25%胰酶（不含EDTA）消化，倒置顯微鏡下見胞體回縮時(shí)輕拍培養(yǎng)瓶，并接著加入含10%小牛血清的DMEM－高糖培養(yǎng)液中止消化，吸管輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，并將細(xì)胞收集于10ml離心管。2000r·min－1離心5min，棄上清，按1：3接種傳代，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 成纖維細(xì)胞的組化鑒定

取P4代細(xì)胞以3－5×104個(gè)·ml－1接種于預(yù)先放有無(wú)菌蓋玻片的6孔板內(nèi)制作細(xì)胞爬片，37℃、5%CO2培養(yǎng)4h后取出爬片，PBS洗3次。4%的多聚甲醛（pH 7.2）固定細(xì)胞30min，PBS洗3次。接下來(lái)按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞鑒定采用免疫化學(xué)染色S－ABC法，一抗為波形蛋白（Vimentin）兔抗單克隆抗體，按1∶100比例稀釋，新鮮配置的DAB顯色液，室溫下顯色約為2－3min，復(fù)染，封片。光學(xué)顯微鏡100倍視野下觀察計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

接種后24h觀察可見有很多長(zhǎng)梭形的細(xì)胞從組織塊周邊遷出，也有部分多邊形的上皮細(xì)胞遷出成團(tuán)生長(zhǎng)，另外可見少量折光強(qiáng)的圓形細(xì)胞，見圖1，該細(xì)胞隨換液和傳代逐漸去除。一般5－6d后原代細(xì)胞鋪滿瓶底80%－90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代比例1∶3。傳代后細(xì)胞形態(tài)較清楚，基本只見胞體細(xì)長(zhǎng)呈長(zhǎng)梭形，核卵圓形居中的成纖維細(xì)胞，見圖1，細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度達(dá)90%左右時(shí)時(shí)細(xì)胞呈柵欄狀、漩渦狀、菜花狀生長(zhǎng)，5－6d后長(zhǎng)至匯合度90%以上，可連續(xù)傳代20次以上。

2.2 免疫組化

細(xì)胞爬片經(jīng)過(guò)固定后，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。通過(guò)摸索一抗和二抗?jié)舛?，發(fā)現(xiàn)在一抗抗Vmientin濃度為1：100，二抗抗山羊抗兔IgG－辣根過(guò)氧化物酶濃度為1：200時(shí)細(xì)胞爬片的免疫組化效果最好，我們的結(jié)果顯示試驗(yàn)組成纖維細(xì)胞幾乎100%Vimentin表達(dá)陽(yáng)性，而陰性對(duì)照爬片無(wú)陽(yáng)性產(chǎn)物，見圖2。

圖1 原代培養(yǎng)細(xì)胞（4×10） 傳代培養(yǎng)細(xì)胞（10×10）

圖2 免疫組化陰性對(duì)照 免疫線化陽(yáng)性結(jié)果

3 討論

不同的細(xì)胞，由于具有不同的功能，分布著不同的蛋白質(zhì)。上皮細(xì)胞具有特異的角蛋白，肌細(xì)胞具有特異的橋連蛋白，而成纖維細(xì)胞則包含有特異的波形蛋白。利用其特異標(biāo)志蛋白，可以成功鑒定成纖維細(xì)胞［2］。本研究利用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合消化法培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞，免疫組化顯示我們所分離培養(yǎng)的細(xì)胞波形蛋白陽(yáng)性，結(jié)合分離時(shí)的組織來(lái)源，以及其生長(zhǎng)形態(tài)特點(diǎn)，證實(shí)其為成纖維細(xì)胞，表明我們培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的方法是穩(wěn)定可行的。

成纖維細(xì)胞是皮膚真皮層疏松結(jié)締組織中，能合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白、層黏蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）［3］。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中的主要結(jié)構(gòu)蛋白。當(dāng)皮膚衰老時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白含量逐漸降低，導(dǎo)致真皮層結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，皮膚失去彈性，出現(xiàn)皺紋［4，5］。成纖維細(xì)胞的成功培養(yǎng)可為人類凹陷性瘢痕修復(fù)和美容除皺提供可靠的細(xì)胞來(lái)源，并且為解決皮膚的大面積創(chuàng)面修復(fù)提供了光明的前景。

1 吳國(guó)平，周燕，譚文松，等.人皮膚成纖維細(xì)胞在二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)代謝特性［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（1）：74－77.

2 楊志明主編.組織工程學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002，155－158.

3 吳國(guó)選，伍津津，朱堂友，等.人皮膚成纖維細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005，22（4）：324－326.

4 王曦.成纖維細(xì)胞與皮膚老化［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2005，14（2）：243－245.

5 Ori T，Okumura M，Matsuura M，et al.Effects of chitinand it s derivatives on the proliferation and cytokine production of fibroblasts in vitro［J］.Biomaterials，1997，8（13）：947－951.