HPLC法測定不同制法的四逆湯中3種苯甲酰類烏頭堿及6—姜酚含量

王海燕?王曉莉?容蓉　鞏麗麗?楊勇?周嚴(yán)嚴(yán)

摘 要 目的 建立高效液相色譜法同時測定四逆湯中苯甲酰類烏頭堿、6-姜酚的含量，比較3種方法制備的四逆湯中有效成分含量差異。方法 苯甲酰類烏頭堿的測定采用C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1 mol·L-1醋酸銨溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為235 nm，柱溫30 ℃。6-姜酚測定采用C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）以乙腈-甲醇-水（ 40： 5： 55）為流動相等度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為280 nm，柱溫25℃。結(jié)果 3種不同方法提取液中苯甲酰類烏頭堿的提取率依次為：有效部位組合法>藥典法>傳統(tǒng)法。6-姜酚的提取率依次為：傳統(tǒng)法>藥典法>有效部位組合法 。結(jié)論 所建立的方法簡單、準(zhǔn)確，為四逆湯提取方法改進(jìn)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 四逆湯 苯甲酰新烏頭堿 苯甲酰烏頭原堿 苯甲酰次烏頭堿 6-姜酚

四逆湯出自《傷寒論》，由附子、干姜、炙甘草組成，用于陽虛欲脫，冷汗自出，四肢厥逆，下利清谷，脈微欲絕等證。近年來研究發(fā)現(xiàn)四逆湯具有很好的抗心肌缺血、再灌注損傷及保護(hù)心肌的作用[1～3]。炮制后的附子中單酯型生物堿是四逆湯抗心肌缺血的關(guān)鍵有效成分[4]，主要包括苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等，干姜中的6-姜酚也是四逆湯重要有效成分之一，具有改善心肌舒縮性能，緩解心衰癥狀作用[5]。本實驗采用HPLC法測定苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、6-姜酚的含量，比較傳統(tǒng)水提法、藥典收錄的水提醇沉法及有效部位組合法制備的四逆湯中以上4種有效成分的含量差異，對四逆湯提取工藝的改進(jìn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司，四元泵、自動進(jìn)樣器、恒溫箱、DAD檢測器，Chem Station 色譜工作站）； Mettler AE240電子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（群山市超聲儀器有限公司）；恒溫振蕩器（國華儀器有限公司）；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

藥材黑附子、甘草、干姜均購于山東濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系李峰教授鑒定為黑附子（毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.）的子根炮制加工品、干姜（姜科植物姜Zingiber officinale Rose.）的干燥根莖、甘草（豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的炮制加工品；苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、6-姜酚對照品（供含量測定用，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號分別為RFS-B-100713、RFS-B-110305、RFS-B-110328、A0218，含量均> 98%）；色譜用水為娃哈哈純凈水，乙腈、甲醇、乙醇、醋酸銨、異丙醇、二氯甲烷為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備 苯甲酰類烏頭堿對照品的制備：分別精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿與苯甲酰次烏頭原堿對照品適量，加入異丙醇-二氯甲烷（1：1）制成濃度分別為0.95 mg·mL-1、0.97 mg·mL-1、1.10 mg·mL-1的單一對照品儲備液。分別精密吸取上述儲備液適量于同一容量瓶中，用異丙醇-二氯甲烷（1：1）稀釋至95 μg·mL-1、97 μg·mL-1、55 μg·mL-1，即得3種組分的混合對照品溶液。

6-姜酚對照品的制備：精密稱取6-姜酚對照品適量，加75%甲醇制成0.7 mg·mL-1的對照品儲備液。精密吸取上述儲備液適量于容量瓶中，加75%甲醇制成濃度為70 μg·mL-1的6-姜酚對照品溶液。

2.1.2 3種不同制法四逆湯供試液的制備 傳統(tǒng)湯劑：黑附子50 g，炙甘草50 g，干姜33 g（均過20目篩），加入8倍量水浸泡1 h后，煎煮30 min，過濾，殘渣加6倍量水煎煮20 min，過濾，濾液合并，濃縮至250 mL，冷藏備用。

藥典復(fù)方提取液：黑附子50 g，炙甘草50g（均過20目篩），加入8倍量水加熱回流提取2 h，過濾，殘渣加6倍量水再加熱回流提取1 h，過濾，濾液合并。取干姜粉末33g（過20目篩），加12倍量水，水蒸氣蒸餾提取5 h，蒸餾后水溶液備用，殘渣加6倍量水煎煮1 h，過濾，煎液合并再與附子、炙甘草提取液合并，濃縮至100 mL，加無水乙醇300 mL，靜置10 h后離心，取上清液，旋蒸濃縮至250 mL，冷藏備用。

有效部位組合液：黑附子粗粉50 g（過20目篩），24倍量pH=1.0鹽酸溶液振蕩提取2次，每次1.5 h，過濾，合并濾液[6]。炙甘草粗粉50 g（過20目篩），20倍量0.3%氨水-60%乙醇加熱回流提取4次，每次2 h，過濾，合并濾液[7]。干姜粗粉33g（過20目篩），14倍量水浸泡3 h后水蒸氣蒸餾提取5 h，蒸餾后水溶液備用，殘渣加6倍量水煎煮1 h，煎液與上次蒸餾后水溶液合并[8]。將各單味藥提取液轉(zhuǎn)移合并濃縮為250 mL，冷藏備用。

2.1.3 HPLC供試液的制備 苯甲酰類烏頭堿供試液的制備：分別取傳統(tǒng)提取液、藥典法提取液、有效部位組合液各10 mL于90℃水浴蒸干（折合溶液中所含黑附子量為2g），精密加入異丙醇-二氯甲烷（1：1）混合溶液溶解殘渣并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，過濾，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過即得復(fù)方供試液1～3。

6-姜酚供試液的制備：分別取傳統(tǒng)法提取液、藥典法提取液、有效部位組合液各5 mL（折合干姜藥材量0.66 g）置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻靜置過夜，過濾，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過即得復(fù)方供試液4～6。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

Aglient Extend XDB-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL；苯甲酰類烏頭堿的流動相為乙腈-0.1 mol·L-1醋酸銨溶液（0 -40 min，25%乙腈→40%乙腈），檢測波長為235 nm，柱溫30 ℃。6-姜酚的流動相為乙腈-甲醇-水（ 40： 5 ：55），30 min等度洗脫，檢測波長為280 nm，柱溫25℃。理論塔板數(shù)以苯甲酰新烏頭堿色譜峰計算不低于3000，以6-姜酚色譜峰計算不低于5000。各待測組分峰與相鄰組分峰可以實現(xiàn)基線分離。娃哈哈純凈水沒有色譜干擾峰。苯甲酰類烏頭堿與6-姜酚的對照品及樣品HPLC色譜圖見圖1，圖2。

2.3 苯甲酰類烏頭堿方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取2.1.1項下混合對照品溶液1，10，20，30，40，50 μL（考察苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿線性關(guān)系）、苯甲酰烏頭原堿單一對照品（0.97 mg·mL-1）1，10，20，30，40，50 μL（考察苯甲酰烏頭原堿線性關(guān)系）；按2.2項下色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品量X/μg對色譜峰面積Y進(jìn)行線性回歸，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的回歸方程分別為Y =1672.1203X-18.2933，r=0.9998；Y =1374.3765X-2.9016，r=0.9998；Y =1467.3624X-5.4255，r=0.9999；線性范圍分別為0.095～4.75 μg，0.97～48.5 μg，0.06～2.75 μg。

2.3.2 精密度試驗 取2.1.1項下混合對照品溶液10 μL，按2.2項下苯甲酰類烏頭堿的色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD分別為0.91%、0.52%和0.52%。結(jié)果表明精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取2.1.2項下傳統(tǒng)法制備的四逆湯溶液6份，每份10 mL，按2.1.3項下苯甲酰類烏頭堿的HPLC供試液處理方法操作，按2.2項下苯甲酰類烏頭堿的色譜條件測得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量平均值分別為44 μg·mL-1、104 μg·mL-1 、20 μg·mL-1；RSD分別為1.65%、1.44%、2.37%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取2.1.3項下苯甲酰類烏頭堿傳統(tǒng)法HPLC供試品溶液，按2.2項下苯甲酰類烏頭堿的色譜條件測定，于室溫下在不同時間點（0，4，8，12，16，20，24 h）進(jìn)行測定，3種苯甲酰烏頭堿類成分RSD分別為1.48%、1.19%、1.31%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗 取2.1.2項下傳統(tǒng)法制備的四逆湯6份，每份5 mL（苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量分別為44 μg·mL-1、104 μg·mL-1 、20 μg·mL-1），分別精密加入苯甲酰新烏頭原堿對照品溶液230 μL （0.95 mg·mL-1）、苯甲酰烏頭原堿對照品溶液540μL（0.97mg·mL-1 ）、苯甲酰新烏頭原堿對照品溶液90μL（1.1 mg·mL-1），按2.1.3項下操作制備苯甲酰類烏頭堿HPLC供試液，按2.2項下苯甲酰類烏頭堿的色譜條件測定，外標(biāo)法測定其含量，計算3種苯甲酰烏頭堿的平均加樣回收率（n=6）分別為98.4%、99.8%、98.8%。RSD分別為1.8%、0.3%、1.6%。結(jié)果見表1。

2.4 6-姜酚方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取2.1.1項下6-姜酚對照品溶液（70 μg·mL-1） 1，5，10，15，20 μl，按2.2項下6-姜酚色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品量X （μg）對色譜峰面積Y進(jìn)行線性回歸，結(jié)果6-姜酚的線性回歸方程Y =47.24X- 4.531，r =1.0000。線性范圍為0.07～1.40 μg。

2.4.2 精密度試驗 分別取2.1.1項下6-姜酚對照品溶液（0.7 mg·mL-1）10 μL，按2.2項下6-姜酚色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算6-姜酚峰面積的RSD為0.09%，表明精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取2.1.2項下傳統(tǒng)法制備的四逆湯溶液6份，每份5 mL，按2.1.3項下6-姜酚的HPLC供試液處理方法操作，按2.2項下6-姜酚的色譜條件測得6-姜酚的平均含量為48 μg·mL-1；RSD為0.37%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取2.1.3項下6-姜酚傳統(tǒng)法HPLC供試品溶液，按2.2項下6-姜酚的色譜條件測定，于室溫下在不同時間點（0，4，8，12，16，20，24 h）進(jìn)行測定，結(jié)果6-姜酚峰面積的RSD為0.15%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗 取2.1.2項下傳統(tǒng)法制備的四逆湯6份，每份2.5 mL（已知6-姜酚含量為48 μg·mL-1），加入6-姜酚對照品溶液170 μL（0.7 mg·mL-1），按2.1.3項下操作制備6-姜酚HPLC供試液，按2.2項下6-姜酚的色譜條件測定分析，結(jié)果6-姜酚的平均回收率（n=6）為99.9%，RSD為1.2%。結(jié)果見表1。

2.5 樣品測定

取2.1.3項下苯甲酰類烏頭堿及6-姜酚的復(fù)方供試品溶液1～6，按2.2項下色譜條件測定。分別計算供試品溶液中苯甲酰類烏頭堿、6-姜酚的含量。結(jié)果見圖1～2和表2。3種方法提取液中甘草苷、甘草酸的含量由課題組研究人員測定[9]。）

2.6 數(shù)據(jù)分析

四逆湯中有效成分較多且含量差異較大，不宜將多個指標(biāo)成分含量直接加和來比較提取方法的優(yōu)劣。故將表2中的數(shù)據(jù)，按照計算公式（1）進(jìn)行z-score標(biāo)準(zhǔn)化（normalization）處理，以消除各指標(biāo)變量單位和量綱不同及范圍相差懸殊造成的影響[10]。標(biāo)準(zhǔn)化處理后結(jié)果見表2。

3 小結(jié)與討論

本實驗建立四逆湯復(fù)方提取液中苯甲酰類烏頭堿、6-姜酚的HPLC測定方法，比較3種不同提取方法即傳統(tǒng)法、藥典法、有效部位組合法所制備的提取液中指標(biāo)成分的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有效部位組合法對復(fù)方中苯甲酰類烏頭堿的提取效率較高。

傳統(tǒng)提取法多為群藥合煎，存在部分有效成分提取率低的缺點；藥典法制備過程涉及水提醇沉，會造成成分損失。本實驗在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)各單味藥所含成分的化學(xué)性質(zhì)，對黑附子中生物堿采用酸水提取[4]，炙甘草甘草酸和甘草苷成分采用氨醇提取[5]，干姜揮發(fā)油水蒸氣蒸餾提取[6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種苯甲酰類烏頭堿成分含量較前2種提取方法高。這說明黑附子酸水提取更有利于生物堿類成分的溶出。推測傳統(tǒng)提取法和藥典提取法中附子和甘草混煎，可能甘草中黃酮類成分與附子中生物堿發(fā)生沉淀反應(yīng)，致使附子生物堿類成分、甘草酸類成分含量較有效部位組合法偏低。

本節(jié)實驗采用z-score標(biāo)準(zhǔn)化方法，這是基于原始數(shù)據(jù)的均值（mean）和標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation）進(jìn)行數(shù)

據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，可以消除指標(biāo)成分之間含量范圍相差懸殊對綜合結(jié)果造成的影響。標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果顯示有效部位組合液中除6-姜酚略低于平均水平，其余5個指標(biāo)成分均高于平均水平，而傳統(tǒng)法及藥典法制備的四逆湯標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)除6-姜酚，其余均低于平均水平；綜合評定，以有效成分提取量計，有效部位組合法提取效果最好，這為四逆湯提取工藝的優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

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