空心蓮子草不同溶劑提取液的抑菌活性研究

范錚　李丹青　張國(guó)亮

摘要：以乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯作為溶劑對(duì)空心蓮子草全草有效成分進(jìn)行提取，采用抑菌圈法比較提取液對(duì)6種受試菌的抑菌作用，用稀釋法測(cè)定對(duì)受試菌的最小抑菌濃度。結(jié)果表明，空心蓮子草提取液有較強(qiáng)的抑菌活性，乙醇、石油醚提取液對(duì)黑曲霉的最小抑菌濃度為0.25%，乙醇提取液對(duì)口腔念珠菌的最小抑菌濃度為0.25%，乙醇提取液抑菌活性總體好于其他溶劑提取液，溶劑影響提取液的抑菌能力。不同溫度處理后乙醇提取液的抑菌活性測(cè)試表明提取液具有較好的熱穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：空心蓮子草；提取液；微生物；抑菌活性

中圖分類號(hào)：R151.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）06-1317-03

空心蓮子草[Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb]又名螃蜞菊、空心莧、水花生、革命草，為挺水型水生植物，一般簇生或大面積形成墊狀物漂于水面，為外來物種。20世紀(jì)30年代傳入中國(guó)，能迅速在水體中滋生、繁衍，對(duì)環(huán)境要求低，現(xiàn)在分布范圍廣，資源極為豐富，可用作飼料、肥料，也用于污染水體的凈化和治理[1，2]?？招纳徸硬莺S酮甙、三萜皂甙、有機(jī)酸、酚類、香豆素、6-甲氧基木犀草素、7-α-L-鼠李糖甙及藤菊黃素等成分[3，4]。中醫(yī)認(rèn)為其性寒、味苦，有清熱、涼血、解毒的功能，可用于流行性乙型腦炎早期、流行性出血熱初期及血尿、尿路感染、麻疹的治療。試驗(yàn)旨在探討空心蓮子草不同提取液對(duì)6種微生物的抑菌作用，希望能找出新的抗菌資源，為天然藥物的開發(fā)利用提供資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

空心蓮子草采自杭州市西湖茅家埠湖面，洗凈、自然曬干后粉碎，取200 g用150 mL乙醇恒溫60 ℃浸泡30 min過濾，濾渣重復(fù)提取3次，合并濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮成2 g的浸膏。同樣方法制得丙酮、乙酸乙酯、石油醚溶液浸膏。

1.2 供試菌種和培養(yǎng)基

大腸桿菌（Escherichia Coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium citrinum）由浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院微生物教研室提供；變形鏈球菌（Streptococcus mutans）、口腔念珠菌（Oral candidosis）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院化驗(yàn)室提供。蛋白胨營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（用于細(xì)菌培養(yǎng)）配方為牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、 瓊脂18 g、水1 L，pH 7.2～7.6；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（用于真菌培養(yǎng)）配方為馬鈴薯20 g、葡萄糖2 g、瓊脂2 g、水1 L。

1.3 試劑及儀器

主要試劑有乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯，為市售分析純；主要儀器有XM-52型高壓蒸氣滅菌鍋、Yamato RE540型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、LRH-250A型生物培養(yǎng)箱、DGG-9053A型恒溫干燥箱、48Q SG4A 280型滅菌箱、SW-CJ-IF型無菌操作臺(tái)、FA-2004型電子天平。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌懸液的制備

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌37 ℃培養(yǎng)24 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，配制成107 CFU/mL的菌懸液。黑曲霉、青霉、口腔念珠菌28 ℃培養(yǎng)48 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，配制成107 CFU/mL的菌懸液[5，6]。

2.2 抑菌活性的測(cè)定

采用濾紙片法測(cè)定抑菌作用。在培養(yǎng)基表面接種50 μL菌懸液并涂布均勻。取各浸膏配制成30 mg/mL提取物溶液（提取液），取已滅菌直徑6 mm干燥濾紙片浸于提取物溶液，濾紙片自然干燥10 min后貼于平板表面，每皿內(nèi)貼4片，以相應(yīng)的溶劑為空白對(duì)照。各皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌37 ℃培養(yǎng)24 h，黑曲霉、青霉、口腔念珠菌28 ℃培養(yǎng)48 h，3次重復(fù)。十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑，取平均值[7-9]。

2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

取各浸膏分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)（濃度）為4.00%、2.00%、1.00%、0.50%、0.25%的提取物平板，吸取0.1 mL的菌懸液加入到平板，用無菌棉簽涂布均勻，置于恒溫箱中（細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃培養(yǎng)48 h）培養(yǎng)后檢測(cè)，以無菌斑產(chǎn)生的最小提取物濃度為最小抑菌濃度（MIC）[10，11]。

2.4 提取液抑菌活性的熱穩(wěn)定性測(cè)定

選用空心蓮子草的乙醇提取物，用無菌水配成10 mg/mL溶液，無菌封裝后分別置于20、40、60、80、100 ℃水浴和120 ℃濕熱條件下處理15 min，按2.2方法測(cè)定其抑菌活性[11]。

3 結(jié)果與分析

3.1 空心蓮子草提取液對(duì)供試菌的抑菌作用

由空心蓮子草提取液對(duì)各供試菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果（表1）可知，幾種有機(jī)溶劑提取液都有較好的抑菌作用，說明提取液中有抑菌的成分。對(duì)不同菌的抑制作用有差異，對(duì)黑曲霉抑菌作用表現(xiàn)較好，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用表現(xiàn)較差，說明不同溶劑的提取液抑菌效果不同，各提取液的抑菌成分存在一定的差異。溶劑影響空心蓮子草的抑菌物質(zhì)提取，也影響提取液的抑菌能力。

3.2 空心蓮子草提取液對(duì)供試菌的MIC

由空心蓮子草提取液對(duì)供試菌的MIC測(cè)定結(jié)果（表2）可以看出，提取液濃度為4.00%時(shí)6種供試菌生長(zhǎng)完全受到抑制，培養(yǎng)皿中無菌斑生長(zhǎng)；隨著提取液濃度的降低，抑菌能力下降，不同提取液對(duì)不同供試菌的作用有所差別。當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇提取液濃度為0.50%時(shí)，6種供試菌的生長(zhǎng)完全受到抑制，為0.25%時(shí)黑曲霉和口腔念珠菌生長(zhǎng)完全受到抑制；當(dāng)培養(yǎng)基中石油醚提取液濃度為1.00%時(shí)，6種供試菌的生長(zhǎng)完全受到抑制，為0.25%時(shí)黑曲霉的生長(zhǎng)完全受到抑制；當(dāng)培養(yǎng)基中丙酮提取液濃度為2.00%時(shí)，6種供試菌的生長(zhǎng)完全受到抑制，為0.50%時(shí)口腔念珠菌的生長(zhǎng)完全受到抑制；當(dāng)培養(yǎng)基中乙酸乙酯提取液濃度為2.00%時(shí)，6種供試菌的生長(zhǎng)完全受到抑制，為0.50%時(shí)變形鏈球菌的生長(zhǎng)完全受到抑制。乙醇、石油醚提取液對(duì)黑曲霉的最小抑菌濃度為0.25%，乙醇提取液對(duì)口腔念珠菌的最小抑菌濃度為0.25%。

從上述結(jié)果可知，乙醇提取液抑菌效果最好；丙酮提取液也有較強(qiáng)的抑菌作用。4種提取液對(duì)黑曲霉、口腔念珠菌抑菌作用較明顯。

3.3 空心蓮子草乙醇提取液抑菌活性的熱穩(wěn)定性

測(cè)定不同溫度對(duì)乙醇提取液抑菌活性的影響（圖1）可知，空心蓮子草乙醇提取液經(jīng)不同溫度處理后，基本保持了原有的抑菌活性，表明提取液的抑菌活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

4 小結(jié)與討論

空心蓮子草提取液具有較強(qiáng)的抑菌作用。4種溶劑提取液對(duì)6種供試菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，說明4種溶劑均能提取空心蓮子草中有效抑菌成分，其中乙醇提取液的抑菌效果較好，幾種提取液對(duì)黑曲霉、口腔念珠菌的抑菌作用較強(qiáng)?？梢娍招纳徸硬菟煞謱?duì)部分微生物有明顯的抑制作用，具體作用成分有待進(jìn)一步分析確認(rèn)。

當(dāng)前新的致病菌不斷出現(xiàn)，而微生物的抗藥性不斷增強(qiáng)，開發(fā)研制新型抗菌藥已顯得越來越重要。中國(guó)植物資源極為豐富，從中提取有效抑菌成分，用以抑制、治療病菌感染有較好的應(yīng)用前景。對(duì)于入侵植物空心蓮子草，如能作為藥品的原料，則可變廢為寶、化害為利。

參考文獻(xiàn)：

[1] 譚萬忠.空心蓮子草在我國(guó)的水平和垂直分布[J].雜草科學(xué)，1994，8（2）：30-33.

[2] 汪 晶.空心蓮子草的研究進(jìn)展[J].科技咨詢導(dǎo)報(bào)，2007（5）：136-137.

[3] DING B Z，SHI G X，XU Y，et al.Physiological responses of Alternanthera philoxeroides （Mart.） Griseb leaves to cadmium stress[J].Environmental Pollution，2007，147（3）：800-803.

[4] 方進(jìn)波，陳家春，劉焱文，等.空心蓮子草化學(xué)成分及抗癌活性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（19）：2473-2476.

[5] 范秀榮，李廣武，沈 萍.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) [M]. 第二版.北京：高等教育出版社，1983.

[6] 戴自英.臨床抗菌藥物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1985.

[7] 曾東方，陳 玢，曾 麟，等. 大蒜素對(duì)三種農(nóng)作物病原真菌的抑制作用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（11）：2447-2449.

[8] 范 錚，徐 俊，鄭曉峰，等.水葫蘆提取物抑菌作用的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：143-144.

[9] 方 芳，張 恒，趙玉萍，等.天門冬的體外抑菌作用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（5）：931-934.

[10] 吳耀輝，曾超珍，龔燕飛.佛肚竹竹葉提取液的抗菌作用[J].食品科技，2010，35（10）：218-221.

[11] 祖麗皮·亞玉努斯，帕提古麗·馬合木.天山花楸葉抗菌作用研究[J].食品科學(xué)，2006，27（8）：34-36.