熒光定量PCR檢測HBV—DNA與ELISA法乙肝免疫學(xué)檢測的探討

黃靜

[摘要] 目的 探討熒光定量PCR法檢測HBV-DNA與ELISA法乙肝免疫學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。 方法 采用ELISA 法和熒光定量PCR技術(shù)分別對353 例乙型肝炎患者血清進(jìn)行免疫學(xué)指標(biāo)的檢測及HBV-DNA 的定量檢測。 結(jié)果 ELISA法呈大三陽組患者的HBV-DNA陽性率及病毒平均拷貝數(shù)均高于小三陽組；HBeAg（+）組的陽性率及病毒平均拷貝數(shù)高于HBeAg（-）組；HBeAb（+）組有較低的HBV-DNA陽性率及病毒平均拷貝數(shù)。 結(jié)論 HBV-DNA 的含量與乙肝免疫學(xué)檢測結(jié)果具有相關(guān)性。臨床上應(yīng)注意兩者聯(lián)合應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] HBV-DNA；ELISA法；乙肝；免疫標(biāo)志物

[中圖分類號] R512.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）06-110-03

乙型肝炎是目前最常見的威脅人類健康的傳染病之一。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，并且近年來其發(fā)病率有上升趨勢[1]。因此做好乙肝的檢測對于傳染病的防控及臨床診治有重要的意義。目前臨床最常用的乙肝篩查及診斷治療的方法是檢測乙肝免疫學(xué)指標(biāo)，即乙肝五項(xiàng)指標(biāo)。而在免疫指標(biāo)檢測方面最常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，它反映人體對HBV的免疫反應(yīng)狀態(tài)，具有快速、價(jià)廉、簡便的特點(diǎn)，適合乙肝的大批量篩查及快速診斷；但是不能直接反映HBV在患者體內(nèi)的復(fù)制情況。而熒光定量PCR檢測HBV-DNA法可直接監(jiān)測血清中乙肝病毒核酸的載量，是判斷病毒復(fù)制活躍程度及是否具有傳染性的可靠依據(jù)，對臨床抗病毒治療及判斷預(yù)后均具有指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年6月～2012年6月在本院門診、住院及健康查體的HBsAg（+）標(biāo)本共353例，其中女157例，男196例。按患者的乙肝病毒血清免疫學(xué)標(biāo)志物組合分為6組：A組（大三陽）HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+），共112例；B組（小三陽）HBsAg（+）、HBeAb（+）、HBcAb（+），共93例；C組 HBsAg（+）、HBeAg（+），共45例；D組 HBsAg（+）、HBeAg（-），共31例；E組 HBsAg（+）、HBeAb（+），共53例。

1.2 研究方法

1.2.1 HBV免疫學(xué)檢測 采用用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法。試劑由上海科華生物工程公司生產(chǎn)，使用BIO-RAD Model 680酶標(biāo)儀比色來判斷結(jié)果。操作過程及結(jié)果判讀按試劑說明書進(jìn)行。

1.2.2 HBV-DNA的測定方法 采用熒光定量PCR測定HBV-DNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的AB I7500 型，HBV-DNA熒光定量PCR試劑盒也由上?？迫A生物工程公司提供，本試劑的定量測定范圍為103～107。操作方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，結(jié)果真實(shí)可信。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS15.0軟件，運(yùn)用x2檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大三陽患者（A組）與小三陽患者（B組）的HBV-DNA定量比較

結(jié)果顯示：大三陽組的HBV-DNA陽性率為95.54%。

小三陽組的HBV-DNA陽性率為52.69%。其陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。并且大三陽組的HBV-DNA的平均拷貝數(shù)為7.02×107，明顯高于小三陽組。見表1。

2.2 HBsAg（+）、HBeAg（+）患者（C組）與HBsAg（+）、HBeAg（-）患者（D組）的HBV-DNA含量結(jié)果比較

如表2所示：C組HBV-DNA陽性率為71.11%。D組的HBV-DNA陽性率為22.58%，其陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 HBsAg（+）、HBeAb（+）患者（E組）與HBsAg（+）、HBeAg（+）患者的HBV-DNA含量比較

表3顯示E組的陽性率陽性患者的平均拷貝數(shù)均低于C組（P<0.05）。

3 討論

乙型肝炎病毒（HBV）感染是目前世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。它傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，且感染者部分易轉(zhuǎn)變成慢性肝炎，并容易繼發(fā)肝硬化、肝癌等疾病[2]。我國屬于“乙肝大國”，據(jù)我國衛(wèi)生部1992～1995年全國病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查公布的數(shù)據(jù)顯示[3]：我國人群乙肝病毒攜帶率為9.75%，總數(shù)約為1.2億，嚴(yán)重危害我國人民的生命健康。因此，采取有效的方法做好乙肝的檢測對于及時(shí)發(fā)現(xiàn)患者、切斷傳播及進(jìn)行臨床診治均有重要的意義。

目前血清標(biāo)志物的檢測方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA法）、化學(xué)發(fā)光法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、放射免疫法、膠體金法、免疫層析法等[4]。這其中ELISA法因其操作簡單、成本低廉，、方便快速、靈敏度和特異度較高等特點(diǎn)得到了臨床廣泛應(yīng)用。是目前對HBV感染的常規(guī)檢查方法。但ELISA法的缺點(diǎn)是只能得到定性結(jié)果，是HBV感染的間接依據(jù)，不能及時(shí)、動態(tài)地反映體內(nèi)病毒復(fù)制情況及傳染危險(xiǎn)程度。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行HBV-DNA定量檢測是HBV感染最直接的指標(biāo)，并且其特異性強(qiáng)、靈敏性高[5]，能直接反映乙肝病毒的復(fù)制水平及傳染性。但是HBV-DNA檢測卻不能明確非復(fù)制狀態(tài)的感染。故臨床上常常進(jìn)行兩者聯(lián)合檢測。

本次檢測結(jié)果顯示，在乙肝病毒感染者中“大三陽”患者的PCR檢測結(jié)果符合率極高，達(dá)到95.54%；且病毒含量高，平均拷貝數(shù)為7.02×107，表明病毒復(fù)制活躍，傳染性極強(qiáng)，與此前相關(guān)報(bào)道基本一致[6-7]。這說明乙肝免疫標(biāo)志物的組合HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+）能夠很好地反映乙肝的感染及傳染情況，臨床意義明確。小三陽組HBV-DNA陽性率為52.69%，平均HBV-DNA拷貝數(shù)為4.21×105，陽性率及平均拷貝數(shù)均低于大三陽組。這可能與HBeAg轉(zhuǎn)陰而產(chǎn)生HBe-Ab有關(guān)，患者體內(nèi)乙肝病毒含量下降，傳染性降低。但這并不表示患者體內(nèi)已沒有病毒復(fù)制；小三陽患者有半數(shù)以上體內(nèi)仍有較高病毒載量，且有部分（本研究結(jié)果為23.66%）患者體內(nèi)有很高的病毒載量（>1×107）。而HBsAg（+）、HBeAg（+）患者與HBsAg（+）、HBeAg（-）患者的HBV-DNA含量比較類似于大三陽與小三陽組的比較，結(jié)果顯示HBeAg（+）組的DNA陽性率及平均拷貝數(shù)均高于HBeAg（-）組。這再次表明HBeAg的存在與HBV-DNA的含量具有相關(guān)性。何大源等[8]研究表明，高水平的HBeAg是病毒復(fù)制的標(biāo)志。而HBeAg轉(zhuǎn)陰表明患者體內(nèi)的HBV-DNA的復(fù)制正在減少，這有利于了解患者的病情并對抗病毒的療效檢測提供了參考依據(jù)[9]。而對HBsAg（+）、HBeAb（+）患者與HBsAg（+）、HBeAg（+）患者進(jìn)行的檢測結(jié)果證明HBeAg（+）的出現(xiàn)表明患者的病毒復(fù)制較少，傳染性減弱。

綜上所述，判斷乙型肝炎患者的病毒復(fù)制情況及是否具有傳染性方面，熒光定量PCR檢測HBV-DNA法要明顯優(yōu)于ELISA法；但在病毒感染分析、疾病進(jìn)程及HBV-DNA陰性患者的病情判斷方面，ELISA法為代表的免疫學(xué)指標(biāo)有著不可替代的作用。在臨床工作中我們既需要應(yīng)用免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行乙肝病毒感染的篩檢、快速診斷及病情進(jìn)展的評估，也需要相對精確了解體內(nèi)HBV的復(fù)制水平；兩者結(jié)合對早期診斷HBV感染、判斷是否進(jìn)行抗病毒治療及療效觀察提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而達(dá)到降低感染率、減緩乙肝進(jìn)程、提高患者生存質(zhì)量的目的。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Jinlin Hou，Zhihua Liu，F(xiàn)an Gu.Epidemiology and Prevention of Review Hepatitis B Virus Infection[J].Int J Med Sci，2005，2（1）：50-57.

[2] Xin Zheng，Klaus M. Weinberger，Ralph Gehrke，et al.Mutant hepatitis B virus surface antigens（HBsAg）are immunogenic but may have a changed specificity[J].Virology，2004，329：454-464.

[3] 中華人民共和國.2006～2010年全國乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃[S]. 2006-01-28.

[4] 趙秀英，陳俊梅，辛永梅，等.不同方法檢測乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物的差異[J].肝臟，2008，13（4）：303-305.

[5] 熊英.乙型肝炎病毒敏感性指標(biāo)檢測的臨床意義[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（14）：2962-2964.

[6] 陳偉，鄧少麗，常曉松.定量PCR檢測乙肝患者HBV2DNA及其意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，13（13）：20.

[7] 劉寶芳.各型乙型肝炎患者血清HBV DNA水平與臨床的關(guān)系[J].中華肝臟病雜志，2002，10（1）：65.

[8] 何大源，黃玉嘉，楊波.乙型肝炎病毒載量與乙型肝炎兩對半之間的關(guān)系[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4（9）：822-823.

[9] 張高明，張國明，馬小波，等.乙型肝炎患者血清中抗原與病毒DNA關(guān)系探討[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8（20）：42-43.

（收稿日期：2013-03-11）