HPLC法測(cè)定四季三黃片中大黃素、大黃酚的含量

武曉紅?敬永升?劉曉軍

[摘要] 目的 采用高效液相法測(cè)定四季三黃片中大黃素、大黃酚的含量。 方法 用高效液相色譜檢測(cè)法，Elite C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇∶水（87∶13，pH=4.5），流速為 1.000 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫：室溫。 結(jié)果 大黃素和大黃酚分別在10.1～50.5μg/mL和9.97～99.7μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為100.8%和100.2%。 結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、靈敏、可靠、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

[關(guān)鍵詞] 四季三黃片；大黃素；大黃酚；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）06-96-03

四季三黃片由大黃、黃芩、梔子、黃柏四味藥組成。該藥消炎退熱，通便利水，用于口鼻生瘡，咽疼齒痛，口干舌燥，目眩頭暈，大便秘結(jié)，小便赤黃[1]，具有消炎退熱、通便利水的功效[2]，臨床上主要用于口舌生瘡、咽喉腫痛、頭暈?zāi)垦５劝Y[3]。其主要成分大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim. Ex Balf）或藥用大黃（Rheum officinale Bail）的干燥根及根莖。具有瀉熱通便、解毒消癰、行瘀通經(jīng)、清熱除濕之功效。臨床用于胃腸實(shí)熱積滯、大便秘結(jié)、腹部脹滿、熱毒瘡瘍、暴赤眼痛、口舌生瘡、齒齦腫痛、濕熱壅滯之黃疸、小便不利、大便干結(jié)等[4]。其中大黃素和大黃酚是大黃的主要有效成分[5]。目前測(cè)定大黃素和大黃酚含量的方法多為HPLC法，也有薄層掃描法。本研究采用HPLC法對(duì)四季三黃片中大黃的主要有效成分大黃素和大黃酚進(jìn)行含量測(cè)定[6]。結(jié)果表明，使用該法測(cè)定時(shí)，其線性關(guān)系好、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于大黃素和大黃酚的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC–10AT型高效液相色譜泵（日本島津）；SPD–10A型紫外檢測(cè)器（日本島津）；N–2000雙通道色譜工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息有限公司）；色譜柱Hypersil–ODS（4.6 mm×150 mm，5 ?m，大連依利特科學(xué)儀器有限公司）；AG135型電子天平（瑞士，梅特勒-托利多）；HS10260D型超聲波清洗機(jī)（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）等。

1.2 試劑

大黃素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110756-200110）；大黃酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110796-200716）；四季三黃片（江西華太藥業(yè)有限公司，批號(hào)：091039）；甲醇（一級(jí)色譜純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；純凈水（樂(lè)百氏有限公司）；冰醋酸（分析純，萊陽(yáng)化工實(shí)驗(yàn)廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件選擇

色譜柱：Hypersil-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5?m）購(gòu)自大連依利特公司，流動(dòng)相：甲醇-水（87∶13），用醋酸調(diào)pH=4.50，流速：1.000 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫：室溫，進(jìn)樣量：20?L。在此色譜條件下，得到大黃素、大黃酚對(duì)照品混合溶液的HPLC圖譜（圖1）及供試品溶液的HPLC圖譜（圖2）。

1.大黃素峰；2.大黃酚峰

1.大黃素；2 .大黃酚

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大黃素對(duì)照品，大黃酚對(duì)照品適量，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，超聲20 min，既得濃度為101.00μg/mL的大黃素對(duì)照品溶液和濃度為99.70μg/mL的大黃酚對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品的制備 取供試品10片，精密稱量，去包衣，研細(xì)，精密稱取0.9953 g于25 mL容量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min，加甲醇至刻度，靜置，濾過(guò)，取濾液搖勻既得供試品溶液，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下的大黃素對(duì)照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每毫升含大黃素10.1、20.2、30.3、40.4、50.5μg的大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另精密吸取2.2.1項(xiàng)下的大黃酚對(duì)照品溶液1.00、3.00、5.00、7.00、10.00 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每毫升含大黃酚9.97、29.9、49.9、69.8、99.7μg的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取20 ?L注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。每種濃度進(jìn)樣三次，取其3次峰面積平均值，結(jié)果見(jiàn)表1～2。以大黃素、大黃酚濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程：大黃素Y=33 232X+233.72（r=0.9999）；大黃酚Y=41 442X+160 000（r=0.9997）。結(jié)果表明大黃素在10.1～50.5μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系；大黃酚在9.97～99.7μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取線性關(guān)系項(xiàng)下的大黃素對(duì)照品溶液（50.5μg/mL）20 ?L，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，記錄色譜圖，平均峰面積為1675 125.333，RSD=0.91%（n=6）。取線性關(guān)系項(xiàng)下的大黃酚對(duì)照品溶液（49.9μg/mL）20 ?L，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，記錄色譜圖。平均峰面積為2 182 387.833，RSD=0.84%（n=6）。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備1份樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)行測(cè)定，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖。大黃素和大黃酚的RSD分別為1.26%和0.67%。結(jié)果表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 同一批樣品6份取，按2.4含量測(cè)定項(xiàng)下方法配制樣品溶液，取每份溶液20 ?L進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定大黃素和大黃酚峰面積，計(jì)算大黃素RSD為0.83%，大黃酚RSD為0.91%。見(jiàn)表6。結(jié)果表明，該法重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取含量測(cè)定項(xiàng)下已知含量（大黃素0.2355 mg/片、大黃酚0.4007 mg/片）的供試品儲(chǔ)備液（批號(hào)：091039）5.00 mL于10 mL容量瓶中，在此容量瓶中精密加入大黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.50 mL，大黃酚對(duì)照品儲(chǔ)備液2.50 mL，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，超聲20 min，用0.45 ?m的濾膜過(guò)濾即得。進(jìn)樣6次，每次進(jìn)20 ?L，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。測(cè)得大黃素的回收率為100.8%，結(jié)果見(jiàn)表1；大黃酚的回收率為100.2%，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 樣品測(cè)定

按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的配制方法制備6份（3批）四季三黃片供試品溶液，分別用0.45 ?m濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件每份進(jìn)樣3次， 每次進(jìn)樣20?L，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，由峰面積根據(jù)回歸方程計(jì)算大黃素、大黃酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表3、4。

3 結(jié)論

市場(chǎng)三黃片的銷售量很大，很多廠家生產(chǎn)的三黃片未按處方投料等存在質(zhì)量問(wèn)題，為了保證臨床用藥和個(gè)人用藥的安全性和有效性。制備工藝的規(guī)范也非常重要，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)四季三黃片中大黃素、大黃酚的含量進(jìn)行測(cè)定。四季三黃片中大黃素、大黃酚的含量是主要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這項(xiàng)工作科學(xué)的評(píng)價(jià)該藥品的質(zhì)量，具有重要意義。實(shí)驗(yàn)表明其線性關(guān)系良好，穩(wěn)定性及重復(fù)性均較好，精密度好、準(zhǔn)確度高，可作為該產(chǎn)品含量測(cè)定的可靠方法。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2013-01-21）