猴頭菇菌絲體和發(fā)酵液中多糖的含量測(cè)定

劉曉明?閆云宇?畢華?高振強(qiáng)

1.河北省食品藥品檢驗(yàn)院，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北石家莊 050051

[摘要] 目的 分別測(cè)定猴頭菇菌絲體、猴頭菇發(fā)酵液提取的粗多糖中的多糖含量。 方法 采用蒽酮-硫酸比色法，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定多糖含量，樣品與對(duì)照品分別在450～750 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。 結(jié)果 最大吸收波長(zhǎng)為（625±1）nm，猴頭菇多糖檢測(cè)濃度在20～100?g/mL（r2=0.999）范圍內(nèi)與吸光度線(xiàn)性關(guān)系良好；加樣回收率為96.0%。 結(jié)論 猴頭菇菌絲體與發(fā)酵液提取的粗多糖中多糖含量均能達(dá)到30%以上。

[關(guān)鍵詞] 猴頭菇菌絲體；猴頭菇發(fā)酵液；多糖；含量測(cè)定

[中圖分類(lèi)號(hào)] S646 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）06-94-02

猴頭菌（Hericium erinaceus，Bull.Ex Fr.）又名猬菌、刺猬菌、小刺猴頭、猴菇、猴頭菇，隸屬于擔(dān)子菌門(mén)，齒菌科[1]，是著名的藥食兩用菌。猴頭菇味甘，性平，歸脾、胃經(jīng)。猴頭菇多糖是猴頭菌的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗突變、防輻射等作用[2]。猴頭菇多糖制成的藥物和保健品深受人們喜愛(ài)，開(kāi)發(fā)前景廣闊。目前，通過(guò)猴頭菇子實(shí)體提取猴頭菇多糖的方法研究較多，但猴頭菇子實(shí)體的生長(zhǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng)，本文研究的是發(fā)酵的方法獲得的多糖，具有生長(zhǎng)周期短，提取多糖速度快的特點(diǎn)。因此，液體深層發(fā)酵是開(kāi)發(fā)猴頭菇活性成分的有效手段。但是在發(fā)酵獲得多糖的方法中，采用菌絲體提取多糖的研究較多，而積極利用發(fā)酵液提取多糖的方法較少報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)猴頭菇菌絲體和發(fā)酵液提取的多糖含量進(jìn)行比較，把發(fā)酵液也積極的利用起來(lái)，為猴頭菇多糖更好的開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫外可見(jiàn)分光光度儀GBC Cintra10（澳大利亞GBC公司），高效液相（美國(guó)Waters公司），旋渦混合振蕩器（江蘇海門(mén)其林醫(yī)用儀器廠(chǎng)），恒溫水浴鍋（北京靖衛(wèi)科學(xué)儀器廠(chǎng)）。D-無(wú)水葡萄糖（中國(guó)藥品生物制品檢定所），蒽酮（北京金

龍化學(xué)試劑有限公司），濃硫酸、95%乙醇、氯仿均為分析純，猴頭菇菌種為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 多糖的提取與精制

1.2.1 猴頭菇菌絲體的多糖提取[3] 取猴頭菇成熟的菌絲體粉末（20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批）各5 g，加入20倍的水在80℃水浴中提取3 h，5000 r/min離心10 min[2]，取上清液。60℃下減壓濃縮至30 mL，過(guò)濾，濾液離心，取上清液，加入5倍體積的無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜。抽濾，沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，置干燥箱中60℃干燥，得粗多糖。

1.2.2 猴頭菇菌絲體發(fā)酵液的多糖提取[4] 取猴頭菇成熟的菌絲體發(fā)酵液（20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批），過(guò)濾，濾液離心，取上清液1000 mL。60℃下減壓濃縮至300 mL，過(guò)濾，濾液離心，取上清液，加入5倍體積的無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜。抽濾，沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，置干燥箱中60℃干燥，得粗多糖。

1.3 含量測(cè)定方法的建立

1.3.1 葡萄糖對(duì)照品溶液的配制[5] 精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25 mg用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，制成濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備 猴頭菇多糖適量配制成濃度約為30 ?g/mL的溶液。樣品溶液取1 mL加入4 mL 0.1%蒽酮-硫酸溶液，搖勻，置沸水中煮沸10 min，取出迅速放冷，在黑暗中放置10 min。顯色后樣品采用用紫外分光光度法在波長(zhǎng)625 nm下測(cè)定含量。

1.3.3 蒽酮-硫酸溶液的配制[6] 取98%硫酸和蒸餾水適量，配制成72%硫酸液，精密稱(chēng)取蒽酮適量，用72%的硫酸溶液配制成含蒽酮0.1%的蒽酮-硫酸溶液。

1.3.4 吸收波長(zhǎng)選擇 取對(duì)照品適量配制成濃度為30 ?g/mL的溶液。再取樣品猴頭菇多糖適量配制成濃度約為30 ?g/mL的溶液。對(duì)照品、樣品溶液各取1 mL分別加入0.1%蒽酮-硫酸液4 mL，搖勻，置沸水中煮沸10 min，取出迅速放冷，在黑暗中放置10 min。顯色后將葡萄糖對(duì)照品、猴頭菇多糖樣品在紫外分光光度儀中分別在450～750 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果猴頭菇多糖樣品和葡萄糖對(duì)照品最大吸收波長(zhǎng)分別在625.2 nm和625.8 nm，故選定（625±1）nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備[7] 精密稱(chēng)取葡萄糖對(duì)照品配成0.5 mg/mL的溶液，從中分別吸取0 mL（空白），0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置于10 mL容量瓶中用蒸餾水定溶至刻度，配制成濃度為0、20、40、60、80、100 ?g/mL的溶液，作3組與此同樣的平行樣品。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

精密吸取每組中各個(gè)濃度對(duì)照品溶液1 mL分別置于試管中，照1.3.2項(xiàng)下顯色方法顯色，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算得回歸方程：Y=0.007X-0.0133，r2=0.999。結(jié)果表明，葡萄糖液在20～100 ?g/mL與吸光度值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。本方法適用于測(cè)定濃度在20～100 ?g/mL的猴頭菇多糖。

2.2 精密度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取0.1572 g樣品，定容于100 mL容量瓶中，待溶解完全后，精密量取1 mL定溶于10 mL容量瓶中，再取1 mL于試管中，共配制5份同樣的稀釋液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)項(xiàng)下操作。結(jié)果RSD為0.13%（n=5），表明精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品（A）和對(duì)照品（B）溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)項(xiàng)下操作，進(jìn)行紫外測(cè)定。每隔15 min測(cè)定一次紫外吸收值，樣品的RSD值為0.74%（n=8），對(duì)照品的RSD值為0.50%（n=8）。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，此方法在2 h內(nèi)穩(wěn)定可行，超過(guò)2 h后樣品和對(duì)照品均有較大變化，因此本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，應(yīng)該在2 h內(nèi)完成。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

取猴頭菇多糖的干燥粉末，精密加入葡萄糖對(duì)照品適量，照2.4項(xiàng)下方法操作，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為96.0%，RSD為1.12（n=6）。見(jiàn)表1。

2.5 猴頭菇多糖樣品溶液的含量測(cè)定

精密稱(chēng)取20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批猴頭菇菌絲體提取的粗多糖和猴頭菇菌絲體發(fā)酵液提取的粗多糖約0.16 g用蒸餾水定溶于100 mL，精密量取1 mL該溶液分別稀釋至10 mL，將稀釋液分別按2.4項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度。含量測(cè)定得樣品中多糖含量見(jiàn)表2。

3 結(jié)論

目前對(duì)猴頭菇菌絲體提取多糖的報(bào)道較多，而對(duì)其發(fā)酵液的多糖提取及利用較少。實(shí)驗(yàn)中本研究采用蒽酮-硫酸比色法分別對(duì)猴頭菇菌絲體和發(fā)酵液提取的粗多糖進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明兩者提取的粗多糖含量相差較小，均在30%以上，因此通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)猴頭菇多糖時(shí)，菌絲體和發(fā)酵液均可獲得可利用的多糖。積極利用起發(fā)酵液提取粗多糖，可以有效的提高猴頭菇粗多糖的產(chǎn)量，從而更好的開(kāi)發(fā)其產(chǎn)品。

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（收稿日期：2013-02-18）