非小細(xì)胞肺癌血清MGMT、RASSF2、RUNX3及RASSF1A基因啟動(dòng)子CpG島甲基化的聯(lián)合檢測(cè)及意義

趙培革?魯?shù)芦\?姬曉青?趙琦?劉忠志?孫立紅

[摘要] 目的 探討非小細(xì)胞肺癌患者血清中人類O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）、RASSF2、人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3、RAS相關(guān)區(qū)域家族1A基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀況及其臨床意義。 方法 基因測(cè)序法檢測(cè)62例NSCLC患者（肺癌組）和30例肺部良性疾病患者和16例健康體檢者（對(duì)照組）血清中MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀況，并分析目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀況與臨床特征的關(guān)系。 結(jié)果 肺癌組MGMT基因甲基化頻率為27.42%（17/62），而對(duì)照組為0（0/46）（x2=14.97，P<0.01）；MGMT基因甲基化狀態(tài)與年齡、性別、病理類型和分化狀況無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05）。甲基化組吸煙指數(shù)（620.78±135.34）高于非甲基化組（498.96±150.87）（t=2.91，P<0.05）。MGMT基因甲基化多見(jiàn)于晚期患者，Ⅰ～Ⅱ期甲基化率為0（0/11）而Ⅲ～Ⅳ期為33.33%（17/51）（Fisher精確概率法，P<0.05）。肺癌組RASSF2基因甲基化頻率為38.71%（24/62），而對(duì)照組為0（0/46）（x2=22.89，P<0.01）；NSCLC患者血清RASSF2基因甲基化檢出率與年齡、性別、病理類型、臨床分期、分化程度無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05），不吸煙者RASSF2甲基化率高于吸煙者（61.90% vs 26.83%，x2=7.20，P<0.05）。 結(jié)論 MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因異常甲基化在NSCLC患者外周血中有較高的發(fā)生率。MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因異常甲基化狀態(tài)可能和患者臨床資料有一定關(guān)系。MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因異常甲基化可能在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因異常甲基化狀態(tài)有望成為NSCLC輔助診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)記。

[關(guān)鍵詞] 肺腫瘤；非小細(xì)胞；人類O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶；RASSF2；人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3；RAS相關(guān)區(qū)域家族1A

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）06-20-05

在大腸癌、乳腺癌等腫瘤中，RASSF2經(jīng)常發(fā)生甲基化。RAS相關(guān)區(qū)域家族1A（RAS association domainfamily 1A，RASSF1A）是RAS凋亡家族成員，定位于3p21.3[1]，該基因啟動(dòng)子CpG島高甲基化造成的基因表達(dá)沉默在許多腫瘤中出現(xiàn)。本研究采用基因測(cè)序法（bisulfite genomic sequence）和（或）甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法（methylation specificity polymerase chain reaction，MS-PCR）檢測(cè)并比較62例NSCLC患者和30例肺部良性疾病患者和16例健康志愿者外周血清中MGMT、RASSF2、RUNX3、RASSF1A等基因的甲基化狀態(tài)，比較目標(biāo)基因的甲基化率與臨床特征的關(guān)系，探討其臨床意義。為肺癌早期診斷、監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷及進(jìn)一步早期治療等提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2008年12月～2011年12月本院呼吸內(nèi)科住院治療的62例NSCLC患者為研究對(duì)象，其中男40例，女22例；年齡42～75歲，平均（59.6±6.5）歲。全部病例均經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)，所有患者均未行放、化療。按病理形態(tài)學(xué)分類，鱗癌27例，腺癌35例，按分化程度分高分化13例，中分化17例，低分化和未分化32例，按2003年國(guó)際抗癌聯(lián)盟制訂的TNM分期法進(jìn)行分期TNM分期[2]：Ⅰ期1例，Ⅱ期10例，Ⅲ期24例，Ⅳ期27例。肺部良性疾病患者系本院呼吸內(nèi)科同期住院治療的30例患者，男18例，女12例；年齡45～74歲，平均（58.1±6.9）歲；其中肺部感染8例，慢性阻塞性肺疾病15例，氣胸7例。16例健康志愿者為本院查體中心體檢者。男10例，女6例；年齡46～68歲，平均（57.3±6.8）歲。3組性別（x2=0.18，P>0.05）、年齡（方差分析，F(xiàn)=1.05，P>0.05）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有患者均于確診后放化療前凌晨空腹采集外周靜脈血5 mL，健康志愿者血液標(biāo)本由本院查體中心提供。標(biāo)本4℃靜置2 h，3000 r/min離心10 min，留取血清，將血清標(biāo)本置-80℃保存。

1.2.2 血清DNA提取 采用QIAamp Blood Mini Kit DNA抽提試劑盒（QIAGEN公司，德國(guó)）提取血清DNA。每份標(biāo)本使用2 mL血清，按照說(shuō)明成比例地增大所需的反應(yīng)試劑用量，多次過(guò)離心柱，最后以50 μL滅菌去離子水洗脫DNA，-80℃保存。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾 參照Z(yǔ)inn RL等[3]的方法，對(duì)所提取的血清DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║）。

1.3 PCR擴(kuò)增

1.3.1 MGMT的PCR擴(kuò)增

1.3.1.1 MGMT的CpG島信息 MGMT基因的CpG島位于染色體（chr10：131154939-131155700），共762個(gè)bp，（C+G）%為56.8%。具體序列如下：

CGCGCTCCGGGCTCAGCGTAGCCGCCCCGAGCAGGACCGGGATTCTCACTAAGCGGGCGCCGTCCTACGACCCCCGCGCGCTTTCAGGACCACTCGGGCACGTGGCAGGTCGCTTGCACGCCCGCGGACTATCCCTGTGACAGGAAAAGGTACGGGCCATTTGGCAAACTAAGGCACAGAGCCTCAGGCGGAAGCTGGGAAGGCGCCGCCCGGCTTGTACCGGCCGAAGGGCCATCCGGGTCAGGCGCACAGGGCAGCGGCGCTGCCGGAGGACCAGGGCCGGCGTGCCGGCGTCCAGCGAGGATGCGCAGACTGCCTCAGGCCCGGCGCCGCCGCACAGGGCATGCGCCGACCCGGTCGGGCGGGAACACCCCGCCCCTCCCGGGCTCCGCCCCAGCTCCGCCCCCGCGCGCCCCGGCCCCGCCCCCGCGCGCTCTCTTGCTTTTCTCAGGTCCTCGGCTCCGCCCCGCTCTAGACCCCGCCCCACGCCGCCATCCCCGTGCCCCTCGGCCCCGCCCCCGCGCCCCGGATATGCTGGGACAGCCCGCGCCCCTAGAACGCTTTGCGTCCCGACGCCCGCAGGTCCTCGCGGTGCGCACCGTTTGCGACTTGGTGAGTGTCTGGGTCGCCTCGCTCCCGGAAGAGTGCGGAGCTCTCCCTCGGGACGGTGGCAGCCTCGAGTGGTCCTGCAGGCGCCCTCACTTCGCCGTCGGGTGTGGGGCCGCCCTGACCCCCACCCATCCCGGGCGAGCTCCAGGTGCG

1.3.1.2 MGMT的引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)體系 參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)MGMT引物，分別識(shí)別甲基化特異性（M）和非甲基化特異性序列（U）。MGMT具體序列為：M正義引物：5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'，M反義引物：5'-GCACTCTTCCGAAA-ACGAAACG-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物大小81 bp。U正義引物：5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3'，U反義引物：5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物大小93 bp。

PCR反應(yīng)體系20 μL，其中去離子水14.95 μL，10×PCR緩沖液 2 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL，dNTPs （10 mmol/L）0.25 μL，上下游引物各0.2 μL （25 pmol），修飾后的DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶（10 U/μL）0.2 μL，充分混勻后置DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 sec、66℃退火35 sec、72℃延伸40 sec，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3.2 RASSF2的PCR擴(kuò)增

1.3.2.1 RASSF2的CpG島信息 RASSF2基因的CpG島位于染色體（chr20：47537-4752146），共1133個(gè)bp，（C+G）%為64.4%。具體序列如下：

CGAAAAACACGTTCTAGGCGCCGGGATTCCAGATACCTGGGAAATAGAGTGCACGCAGCTGTTGAGAGGCCTCGCGCTTGGCTTCTCCTATCACTGAGGCGCAGAGGTGCTGTGGACAGCCCAGACCCACACGGCGCCCGAGGTGAAACAGAACCCTCAGTCTCCCTATGAGGCCACTGGCACTCTCGGCTGTCCCCAGAGCTCTCCGACTTAGAGCTGAATGCAAAGTAAGCGCTCGAAATGCAGAAGTAGCCGGGGCCGCCCACGGCACCTGCCTCGCTCGGGGCGAGAGAAGACGCCAGGCTGAGGTCCCAGCGACCTCAGGCACCAGCTCCGAAGGAGGGCGGGGAGACCGCAAAGGGGAAGTGCCCGGAGGGCCAACGGCCCCCGCGCACCCTGCGCCCCTCTGAAGCGCGCCGCCTCCCCGCGCCGGGGACTGGGACCTGCCTCTGGGGAATCCGCCTAGAAGACGGCGGCGGACTGGGGTCGGGCACTCTCCAGGGCTGTCAGGCCCTCCCCAGCCCTGCACCTGCCGCGCCGCCCCACCTCGCCAGGAAGTCTCAGAGACCCCGGGGATGGGGTGGGAGCGCCTTCCCATCGCGGGCTCAAAAAGAAGGAAGGACGCCCCCAGGGGTCGTAGAAGGAGGACTAGCTCCAAGCCACAACTTTCTTCGGACCCAAGGCAGGCCGGCTGGGGCTCCGCGCCTACACGGCCCCTGGCGGGGGTCCGCGCGCCCCGGGAGCCCCGCGGCTCGGGGAGGAAAGAGGAGACAAGAGACAGGCGAGGATTACGGGGCTGACCCAGCCGGGGTAGGGACCATCGTGGAAAAACTTTGGCGAGGTGGGGGGACGCGGAAAGAGAGCGGCCCGCGCCCTGCACCTTGCGCCGGGCATCCCGCGCCAGTGCCTCGCTCCCAGTGCCCCGCGCCCCGCGCCCCGCGCCTTGCCTTCACCCCGGGCCAGCTGCATCGCGCCCGCGCCGCAGGAACCGTGGAGTTGGAAAGTGGGGGCGCCGCGGCTGGGGGGCTGCTTCAGCTGCGCCTCGGCCAGCGATCGGCGGGCCGGGCTCAAATCCAGCCAGGCTGGGCAGGCGGTGGCCGCGCGACTGGGGACCGGGCGCCCCGCCCTCCTCG

1.3.2.2 RASSF2的引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)體系 參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)RASSF2引物，分別識(shí)別甲基化特異性（M）和非甲基化特異性序列（U）。RASSF2引物具體序列為：M正義引物：5'-CGAAGGAGGGCGGGGAGATC-3'，M反義引物：5'-TCCGCCGCCGTCTTCTAAACG-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物大小148 bp。U正義引物：5'-GTTTTGAAGGAGGGTGGGGAGATT-3'，U反義引物：5'-AATCCACCACCATCTTCTAAACA-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物大小154 bp。

PCR反應(yīng)體系20 μL，其中去離子水14.95 μL，10×PCR緩沖液 2 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL，dNTPs （10 mmol/L）

0.25 μL，上下游引物各0.2 μL（25 pmol），修飾后的DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶（10 U/μL）0.2 μL，充分混勻后置DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 min，55℃變性15 sec，72℃延伸30 sec，共5個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min[5]。

1.4 RUNX3的PCR擴(kuò)增

1.4.1 RUNX3的CpG島信息 RUNX3基因的CpG島位于染色體（chrl：21354-252419），共636個(gè)bp，（C+G）%為69.0%。具體序列如下：

CGAGACCACCCTGGAGCGCAGGTCCCATTCCCGCCCGGAGCCTCGGAGCCGGCCCATCACTGGTCTTGAAGGTTGTTAGGGTCCCCGCCTCCAGCGGGAGGAGTCCACCAGGGCGGTCAGTAGGGCCGCCACACGGCCTCATCCATGCGGCCTGGCGTGCTCAGGGCCGTGGGTGAGTTGCTGTGGCTGCCGTCGGCCTCCACGCCATCACTCTGGCCGCCCAGGCTGGGGTTCATGAGGTTGCCGGCGGCGACAGAGGCAGCGCTGCTGGTGCAAGAGGCCAGCATGCGGGTAGGTGAGCGGTCGCCCCCACTGCTGCTGCCGGCCACCATGGAGAACTGGTAGGAGCCAGAGGATGTCCCGTAGTAGAGGTGGTAGGGGGACGGGTTGGCCTGGAAGGGCCCGCTCTGGTTCTGCGGGGCCCCCGGGTAGGGTGGCGGGAGGTAGGTATGGTGGAAGCGGCTGGTGGCCGGCATGCCCGCCACGCTGAGGCTGCTGATGCTCGTGCCCGAGGGCGTGGCGCTGTAGGGGAAGGCAGCTGACATGGCCCCGGGATAATGCATCCTGGGGTCTGGGAAGCGGCTCTCCGTGAGGGTTGGCAGCGTGGGGAAGGAGCGGTCAAACTGGCGGGGGTCG

1.4.2 RUNX3的引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)體系 參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)RUNX3引物，分別識(shí)別甲基化特異性（M）和非甲基化特異性序列（U）。RUNX3引物具體序列為：M正義引物：5'-GCGGTAAGATGGGCGAGAATA-3'，M反義引物：5'-CACGAACTCGCCTACGTAATC-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物大小234 bp。U正義引物：5'- TGGTAAGATGGGTGAGAATA3'，U反義引物：5'-CACAAACTCACCTACATAATCC-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物大小234 bp。

PCR反應(yīng)體系20 μL，其中去離子水14.95 μL，10×PCR緩沖液 2 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL，dNTPs （10 mmol/L）0.25 μL，上下游引物各0.2 μL（25 pmol），修飾后的DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶（10 U/μL）0.2 μL，充分混勻后置DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 sec，M引物60℃退火40 sec，U引物56℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，共55個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在SPSS13.0版軟件包上完成，定量資料采用t檢驗(yàn)，分類資料采用x2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法檢驗(yàn)，多個(gè)率的比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率

62例NSCLC患者中，有17例血清DNA MGMT基因甲基啟動(dòng)子區(qū)域CpG島發(fā)生了異常的過(guò)度甲基化（圖1），檢出率為27.42%，而良性肺部疾病患者和健康體檢者血清未檢出MGMT基因甲基化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher精確概率法，P<0.05）。

2.2 MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理的相關(guān)性

NSCLC患者血清MGMT基因甲基化狀態(tài)與年齡、性別、病理類型和分化狀況無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05）。甲基化組吸煙指數(shù)（620.78±135.34）高于非甲基化組（498.96±150.87）（t=2.91，P<0.05）。MGMT基因甲基化多見(jiàn)于晚期患者，Ⅰ～Ⅱ期甲基化率為0（0/11）而Ⅲ～Ⅳ期為33.33%（17/51）（Fisher精確概率法，P<0.05）。

2.3 RASSF2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率

62例NSCLC患者中，有24例血清DNA RASSF2基因甲基啟動(dòng)子區(qū)域CpG島發(fā)生了異常的過(guò)度甲基化（圖2），檢出率為38.71%，而良性肺部疾病患者和健康體檢者血清未檢出RASSF2基因甲基化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=22.89，P<0.01）。

2.4 RASSF2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理的相關(guān)性

NSCLC患者血清RASSF2基因甲基化狀態(tài)與年齡、性別、臨床分期、病理類型和分化狀況無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05），與吸煙狀況有關(guān)，吸煙者甲基化率（26.83%，11/41）低于不吸煙者（61.90%，13/21）（x2=7.20，P<0.05）。

2.5 RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率

62例NSCLC患者中，有25例血清DNA RUNX3基因甲基啟動(dòng)子區(qū)域CpG島發(fā)生了異常的過(guò)度甲基化（圖3），檢出率為40.32%，而良性肺部疾病患者和健康體檢者血清未檢出MGMT基因甲基化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher精確概率法，P<0.05）。

3 討論

本研究用基因測(cè)序法檢測(cè)了62例肺癌患者（肺癌組）、30例肺部良性疾病患者和16例健康志愿者（對(duì)照組）外周血血清中MGMT基因啟動(dòng)子的異常甲基化狀態(tài)，肺癌組MGMT基因甲基化頻率為27.42%（17/62），而對(duì)照組為0（0/46），兩組甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MGMT基因甲基化狀態(tài)與年齡、性別、病理類型和分化狀況無(wú)明顯相關(guān)。甲基化組吸煙指數(shù)高于非甲基化組。MGMT基因甲基化多見(jiàn)于晚期患者，Ⅰ～Ⅱ期甲基化率為0（0/11）而Ⅲ～Ⅳ期為33.33%（17/51），與Dammann等[8]研究報(bào)道的結(jié)果相近。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MGMT等基因DNA甲基化狀態(tài)和TNM分期是獨(dú)立的預(yù)后因子。

本研究用基因測(cè)序法檢測(cè)62例肺癌患者（肺癌組）和30例肺部良性疾病患者和16例健康體檢者（對(duì)照組）血清中RASSF2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀況，研究發(fā)現(xiàn)：肺癌組RASSF2基因甲基化頻率為38.71%（24/62），而對(duì)照組為0（0/46），兩組甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RASSF2基因甲基化狀態(tài)與年齡、性別、臨床分期、病理類型和分化狀況無(wú)明顯相關(guān)，與吸煙狀況有關(guān)，吸煙者甲基化率低于不吸煙者。Rong等[10]研究了RASSF2啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞株中RASSF2基因甲基化率為44%（22/50），其數(shù)據(jù)表明，在大腸癌、乳腺癌和肺癌中，RASSF2經(jīng)常發(fā)生甲基化，與本研究結(jié)論相似。

本研究用基因測(cè)序法檢測(cè)62例肺癌患者（肺癌組）和30例肺部良性疾病患者和16例健康體檢者（對(duì)照組）血清中RUNX3、啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀況，研究發(fā)現(xiàn)：肺癌組RUNX3基因甲基化頻率為40.32%（25/62），而對(duì)照組為0（0/46），兩組甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RUNX3基因甲基化狀態(tài)與年齡、性別、吸煙狀況、臨床分期和分化狀況無(wú)關(guān)，與病理類型有關(guān)，腺癌甲基化率高于鱗癌。研究表明，腫瘤患者外周血中存在一定數(shù)量的DNA，并且含量遠(yuǎn)高于正常人，可能來(lái)源于腫瘤細(xì)胞壞死釋放。血清易于取得，因此是理想的DNA甲基化檢測(cè)標(biāo)本。本研究用基因測(cè)序法檢測(cè)了62例NSCLC患者、30例肺部良性疾病患者和16例健康志愿者外周血血清中RASSF1A基因啟動(dòng)子的異常甲基化狀態(tài)，RASSF1A基因甲基化檢出率為45.16%，與Hesson等[11]報(bào)道的結(jié)果相近，略高于Rong等[10]報(bào)道的結(jié)果。而且，RASSF1A啟動(dòng)子甲基化僅在NSCLC患者腫瘤細(xì)胞中存在，提示其具有良好的腫瘤特異性[12-15]。

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（收稿日期：2013-03-03）