谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在高熱驚厥大鼠腦內(nèi)的表達(dá)及意義

周蕊　孫妍　李俊利

【摘要】 目的 探討大鼠反復(fù)高熱驚厥后腦內(nèi)谷氨酸及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)情況，進(jìn)行定性及定量分析。方法 熱水浴法建立FS模型。15日齡雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=10）和高熱處理組（n=50），其中高熱處理組按大鼠是否有驚厥又分為高熱未驚厥組和高熱驚厥組。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)谷氨酸及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在大鼠腦組織各區(qū)的表達(dá)。結(jié)果 ①驚厥對(duì)照組大鼠皮層及海馬CA3區(qū)Glu的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加。②驚厥對(duì)照組大鼠皮層及海馬CA3區(qū)GLT-1的表達(dá)均低于正常對(duì)照組。討論 高熱驚厥時(shí)腦細(xì)胞谷氨酸表達(dá)上升，而腦細(xì)胞膜和細(xì)胞間質(zhì)中的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1表達(dá)下降。

【關(guān)鍵詞】 高熱驚厥；谷氨酸；谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體

高熱驚厥（febrile convulsion，F(xiàn)C）是一種特殊類(lèi)型的癲癇綜合征，是小兒時(shí)期最常見(jiàn)的驚厥性疾病，但反復(fù)發(fā)作或長(zhǎng)時(shí)間發(fā)作的FC可造成腦損傷，目前對(duì)本病的研究仍集中于對(duì)其行為及腦電圖變化的觀察，而對(duì)其神經(jīng)病理改變的研究較少。本研究用熱水浴驚厥模型誘導(dǎo)生后15dWester大鼠發(fā)生熱性驚厥，利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)正常對(duì)照組、高熱及高熱驚厥組大鼠腦內(nèi)谷氨酸及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)情況進(jìn)行定性及定量分析，為熱性驚厥時(shí)的神經(jīng)病理學(xué)研究提供新思路

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 15日齡雄性Wistar大鼠60只，體重30-45g，（購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。自由喂養(yǎng)1d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大鼠稱(chēng)重后編號(hào)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（37.0℃水浴，n=10）和高熱處理組（45.2℃水浴，n=50），其中高熱處理組按大鼠是否有驚厥又分為高熱未驚厥組和高熱驚厥組。從正常對(duì)照、高熱未驚厥和高熱驚厥組中，分別隨機(jī)取10只用于進(jìn)行腦組織免疫組織化學(xué)染色觀察。

1.2 化學(xué)試劑 本實(shí)驗(yàn)中所采用的化學(xué)試劑及免疫組化試劑盒分別購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司及福州邁新生物科技公司。

1.3 熱性驚厥動(dòng)物模型的建立 參照文獻(xiàn)報(bào)道[1]建立熱性驚厥動(dòng)物模型，高熱驚厥組熱水?。核∠錅囟仍O(shè)定為45.2℃。從大鼠生后15d開(kāi)始，隔日誘導(dǎo)驚厥1次，共10次。正常對(duì)照組水浴溫度為37℃，處置方法同高熱驚厥組。記錄大鼠的驚厥潛伏期、驚厥時(shí)體溫、驚厥持續(xù)時(shí)間及驚厥級(jí)別評(píng)[2]（驚厥分級(jí)：0級(jí)0分：無(wú)驚厥；1級(jí)1分：面部抽動(dòng)；2級(jí)2分：點(diǎn)頭；3級(jí)3分：前肢陣攣抽搐；4級(jí)4分：全身強(qiáng)直；5級(jí)5分：全身強(qiáng)直陣攣）。

1.4 腦組織谷氨酸和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)檢測(cè)

1.4.1 腦標(biāo)本取材和切片制備并進(jìn)行免疫組化染色 各組在FC組末次驚厥24h予100g/L水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛PB左心室灌注固定，取腦，后固定6-8h。腦標(biāo)本入30%蔗糖磷酸緩沖液（PH=7.4）過(guò)夜自頭端向尾端連續(xù)凍切腦片，厚30μm切片，連續(xù)取片，三張為一套，分別進(jìn)行尼氏染色組織定位和Glu及GLT-1免疫組化染色。

1.4.2 圖像結(jié)果處理 每張切片分別在海馬CA3區(qū)、顳葉皮層（CTL）隨機(jī)觀察5個(gè)不連續(xù)視野（×400），使用Olympus自動(dòng)圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，腦片呈現(xiàn)棕黃色區(qū)域?yàn)殛?yáng)性反應(yīng)，用IPP軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)數(shù)和平均光密度分析，取其OD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熱水浴誘導(dǎo)大鼠驚厥結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠在37.0℃水浴中，游動(dòng)自如，出水前后無(wú)異常變化。高熱驚厥組大鼠在45.2℃熱水中，每次誘導(dǎo)均發(fā)展為驚厥，驚厥時(shí)的時(shí)體溫在42℃-44℃之間，平均體溫為（42、8±0、4℃），第1次驚厥發(fā)作最長(zhǎng)潛伏期為5min57s，以后隨誘發(fā)次數(shù)的增加，驚厥閾值逐漸降低，驚厥潛伏期呈縮短趨勢(shì)（第2-10次，最長(zhǎng)驚厥潛伏期分別為5min30s、5min19s、4min51s、4min35s、4min2s、3min45s、3min25s、3min4s、2min47s、）。但驚厥發(fā)作程度及發(fā)作時(shí)間無(wú)顯著趨勢(shì)性變化?？偟捏@厥級(jí)別多為4-5級(jí)。驚厥發(fā)作3次后，部分大鼠出現(xiàn)行為改變，表現(xiàn)為易激惹，攻擊性強(qiáng)或反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少。

2.2 谷氨酸（Glu）、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLT-1）在大腦皮層及海馬的表達(dá) 驚厥對(duì)照組大鼠皮層及海馬CA3區(qū)Glu的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加，表現(xiàn)為計(jì)數(shù)、平均光密度與正常對(duì)照組相比增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。驚厥對(duì)照組大鼠皮層及海馬CA3區(qū)GLT-1的表達(dá)均低于正常對(duì)照組，表現(xiàn)為計(jì)數(shù)、平均光密度值較正常對(duì)照組明顯減少（P<0.01），見(jiàn)表2。

3 討 論

人類(lèi)熱性驚厥多發(fā)于6個(gè)月-3歲，研究表明，生后5-7d大鼠的腦發(fā)育程度與足月新生兒的腦發(fā)育程度相當(dāng)，15d大鼠的腦發(fā)育程度與1歲兒童相當(dāng)，28-30d大鼠的腦發(fā)育程度與2歲兒童相當(dāng)[3]。大鼠55d左右進(jìn)入青春期，60d性成熟。本研究中的大鼠從15日齡開(kāi)始，反復(fù)誘發(fā)熱性驚厥，其年齡段與人類(lèi)熱性驚厥的好發(fā)年齡相當(dāng)，模擬人類(lèi)有熱驚厥史的癲癇發(fā)作。

本研究利用熱水浴誘導(dǎo)大鼠FC模型，每2d誘導(dǎo)大鼠FC發(fā)作1次，觀察到大鼠驚厥行為、驚厥時(shí)的體溫、潛伏期及驚厥持續(xù)時(shí)間均與Jiang等[2]的報(bào)道相符，此外，熱水浴誘導(dǎo)模型所需器材簡(jiǎn)單，水溫等因素較易控制，本研究觀察大鼠FC3周，Jiang等觀察大鼠FC時(shí)間長(zhǎng)達(dá)半年，所以該模型是一簡(jiǎn)便易行的FC模型，并適合于長(zhǎng)期觀察與研究。

谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（GluTs）是位于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞膜上的一種糖蛋白，在谷氨酸的再循環(huán)，維持突觸的正常傳遞及保護(hù)神經(jīng)元免受神經(jīng)興奮毒性損害等方面有重要作用。到目前為止，已分離和克隆出五種亞型，即EAAT（EAAT1-EAAT5），EAAT2也稱(chēng)為GLT-1，在中樞神經(jīng)分布廣泛，也表達(dá)在發(fā)育階段的神經(jīng)元上。其轉(zhuǎn)運(yùn)的谷氨酸占全部谷氨酸攝取的90%在生理?xiàng)l件下，EAAT迅速攝取谷氨酸，有效地抑制了細(xì)胞外谷氨酸的堆積。病理情況下，EAAT對(duì)谷氨酸的攝取能力下降或者中斷，甚至出現(xiàn)向細(xì)胞外的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸濃度上升，興奮谷氨酸受體，引發(fā)一系列興奮性毒性。熱性驚厥時(shí)腦缺氧、缺血，谷氨酸由于過(guò)度釋放或攝取障礙而大量積聚，使其腦內(nèi)濃度急劇升高，引起突觸間隙或胞外Glu大量蓄積，通過(guò)作用于相應(yīng)的谷氨酸受體（GluRs）導(dǎo)致Na+、Ca2+內(nèi)流增加，使細(xì)胞急性滲透性腫脹以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，能量消耗、自由基大量形成，嚴(yán)重或反復(fù)發(fā)作將造成腦損傷。本實(shí)驗(yàn)中，熱水浴大鼠產(chǎn)生了與文獻(xiàn)報(bào)道相一致的發(fā)熱乃至驚厥，在此基礎(chǔ)上，觀察了皮層及海馬CA3區(qū)Glu的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)其有顯著升高，而GLT-1的表達(dá)明顯降低。因此上調(diào)GLT-1，增強(qiáng)其對(duì)于谷氨酸的攝取可能在熱性驚厥的發(fā)生機(jī)制和防治中具有重要作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 周?chē)?guó)平，秦炯，湯秀英，等.高熱驚厥大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量和超微結(jié)構(gòu)改變的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華兒科學(xué)雜志，2001，39：105-108.

[2] Jiang W，Duong TM，DeLanerolle NC.Neuropathology of Hyperthermic seizures in the rat[J].Epilepsia，1999，（40）：5-19.

[3] 左啟華，主編.小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002，231-232，425-426.