吉林地區(qū)華支睪吸蟲蟲卵的鑒定及PCR檢測方法的建立

唐藝芝　郝玉花　孫青松等

摘要：對華支睪吸蟲病流行地區(qū)人糞樣進行華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）蟲卵的鑒定、收集及DNA的提取，然后根據(jù)華支睪吸蟲基因設(shè)計兩對特異性引物，以糞便中提取的蟲卵DNA為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法擴增目的基因片段，對PCR方法的各種反應(yīng)條件進行優(yōu)化。結(jié)果兩對引物中以上游引物（5′-TGGCCTGACTGGCTGGCCGG-3′）、下游引物（5′-CGGCACCCCACACACATACA-3′）為最適引物，用PCR方法可擴增到分子量大小為255 bp的特異性條帶，測序結(jié)果經(jīng)BLAST工具進行分析，與中國沈陽分離株（AF217099）和朝鮮分離株（AF217094）的同源性為100%；50 μL PCR反應(yīng)體系的最優(yōu)化反應(yīng)條件為：dNTP 2.6 μL；10×PCR Buffer（含Mg2+）4.0 μL；上下游引物各0.5 μL；DNA模板5.5 μL；Taq DNA聚合酶0.4 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。試驗成功對吉林地區(qū)人糞樣中華支睪吸蟲蟲卵進行了鑒定，并建立了華支睪吸蟲蟲卵PCR檢測方法，為從分子生物學(xué)角度檢測華支睪吸蟲病提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）；蟲卵DNA；鑒定；PCR

中圖分類號：R446.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1601-03

華支睪吸蟲病是廣泛流行于東亞地區(qū)和中國大部分省市的食源性寄生蟲病，由寄生于人體肝膽管內(nèi)的華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）引起，可產(chǎn)生嚴重的肝膽并發(fā)癥，與膽管癌的關(guān)系也非常密切[1-6]。目前，對華支睪吸蟲的研究主要集中在對其成蟲或囊蚴的研究，而對蟲卵的研究甚少，僅限于對蟲卵的形態(tài)學(xué)研究。本試驗采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對人糞便中的蟲卵進行鑒別，從而鑒定人是否患有華支睪吸蟲病，為PCR技術(shù)在華支睪吸蟲病診斷中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

糞樣來自吉林省白城市鎮(zhèn)賚縣流行區(qū)村民。

主要試劑及儀器：2% Triton X-100，KOH，蔗糖/KCl溶液，PCR擴增試劑，T載體，lower DNA Marker，瓊脂糖，DNA凝膠回收試劑盒。Gene Amp PCR systerm 9700（AB公司），AR1140電子天平（USA），PY-120水平脫色搖床（北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心），OLYMPUS CX31RTSF生物顯微鏡，NANODROP2000（Thermo公司），水浴鍋，超凈工作臺，磁力攪拌器，振蕩器，組織勻漿機。

1.2 方法

1.2.1 糞便的收集與篩選 每一糞樣先進行初步篩選，將少量生理鹽水加入糞樣中，洗去微量糞液，洗下的糞液在顯微鏡下觀察，每個糞樣做3個載玻片，若發(fā)現(xiàn)華支睪吸蟲蟲卵，即為陽性；沒有發(fā)現(xiàn)蟲卵則為陰性。將陽性糞便進行收集。

1.2.2 蟲卵的收集 用沉淀集卵法收集蟲卵。先將每個糞樣中加入1 000 mL蒸餾水充分攪拌溶解，用40目篩過濾，除去濾渣后，濾液中再加入500 mL蒸餾水進行溶解攪拌，再用260目篩子進行過濾；濾液中再加入300 mL蒸餾水進行溶解攪拌，充分沉淀后，去上清液，留取沉淀，如此過程進行，依次降低蒸餾水的用量，直到上清液澄清，最后留取沉淀量20 mL，分裝到2 mL EP管中，于-20 ℃保存。

1.2.3 蟲卵DNA的提取 按參考文獻[7]的方法并進行了適當(dāng)改進。將冰凍的含蟲卵的糞便樣品取出，于清水中融化，放入沸水中煮10 min， 12 000 r/min離心5 min，除去少量上清液后，將剩余的液體和沉淀移入2 mL的EP管中，并重懸；將EP管放入沸水中煮5 min， 12 000 r/min離心5 min；去上清液，各管中分別加入2% Triton X-100及KOH各200 μL，振蕩器振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，去上清液，再加2% Triton X-100及KOH各200 μL反復(fù)進行此過程，直至上清液變清澈；去上清液，每管加入800 μL蔗糖/KCl溶液，并充分振蕩均勻后， 12 000 r/min離心8 min；將上清液移入新的2 mL EP管中，蒸餾水加滿，12 000 r/min離心10 min，去上清液，重復(fù)加滿蒸餾水，清洗沉淀，至最后殘留200 μL沉淀物及液體；用組織勻漿機勻漿殘留的沉淀物及液體； 12 000 r/min離心5 min，留取上清液并移入新管中，沸水煮5 min，作為PCR模板。

1.2.4 引物的設(shè)計與選擇 引物設(shè)計根據(jù)華支睪吸蟲基因，用Primer 5.0設(shè)計2對引物如下。

第1對：上游引物Cs1-1：5′-TTAGAGGAGTTG

GTGTCCCC-3′，下游引物Cs1-2：5′-AGCGTCACTG

AACCACACCCAC-3′；

第2對：上游引物Cs2-1：5′-TGGCCTGACTG

GCTGGCCGG-3′，下游引物Cs2-2：5′-CGGCACCC

CACACACATACA-3′。

用Primer 5.0分析軟件分析其可行性，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.5 PCR條件的優(yōu)化 PCR 特異性擴增：PCR反應(yīng)成分為10×PCR Buffer液（含Mg2+）4 μL，2 mmol/L dNTP 2.5～3.0 μL，10 pmol/L上、下游引物各0.5 μL，DNA模板5～6 μL，Taq DNA聚合酶0.25～0.50 μL，滅菌去離子水加至50 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、55～60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min、4 ℃保存。觀察2種引物條帶清晰程度來進行最適引物的選擇。

1.2.6 瓊脂糖凝膠電泳檢測 用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，電泳緩沖液為0.5×TBE，加入少許溴化乙錠（EB）使其終濃度為0.5 μg/mL。將上樣緩沖液與擴增產(chǎn)物以1∶10比例混勻，加樣至樣品孔中，以lower DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量。用5 V/cm的電壓進行電泳，當(dāng)溴酚藍至適當(dāng)位置后，切斷電源，在紫外投射反射儀上觀察電泳結(jié)果并拍照。

1.2.7 連接載體與基因測序 將PCR擴增產(chǎn)物大量回收，用DNA凝膠回收試劑盒回收DNA，然后與T載體進行連接，送上海生工生物工程有限公司進行核苷酸序列測定，運用NCBI中的BLAST工具將測序結(jié)果與基因庫內(nèi)的基因序列進行比對并進行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR優(yōu)化結(jié)果

分別對PCR反應(yīng)體系中的dNTP量、模板量、引物量和Taq DNA聚合酶用量進行優(yōu)化，擬在55～60 ℃的區(qū)間內(nèi)對退火溫度進行摸索，2對引物進行優(yōu)化后最佳結(jié)果見圖1、圖2。結(jié)果顯示第2對引物（圖2）出現(xiàn)的條帶最清晰，而且多次檢測準(zhǔn)確度高，因此選擇第2對引物作為最適引物，摸索后的最佳反應(yīng)條件為：擴增條件為94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min、4 ℃保存。最佳反應(yīng)體系見表1。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，結(jié)果顯示除陰性對照未見條帶外，其余各樣本均可擴增出大小約為255 bp的特異性條帶（圖2）。

2.2 基因序列比對結(jié)果

擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果應(yīng)用BLAST工具進行比對后，發(fā)現(xiàn)其與華支睪吸蟲基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）：中國沈陽分離株（AF217099）和朝鮮分離株（AF217094）的同源性為100%，證實擴增產(chǎn)物為華支睪吸蟲基因的其中一個片段（圖3）。

3 小結(jié)與討論

華支睪吸蟲病的實驗室診斷主要包括病原學(xué)方法和免疫學(xué)方法，分子生物學(xué)診斷方法尚未建立。病原學(xué)檢查以糞便鏡檢蟲卵為主要方法。由于在人體內(nèi)寄生的華支睪吸蟲蟲卵數(shù)一般不多，排卵數(shù)量較少，蟲卵形態(tài)又非常小，該法極易漏診。免疫學(xué)診斷技術(shù)因其具有較高敏感性和特異性，操作簡便易行，但現(xiàn)已研制出的免疫學(xué)診斷方法因使用的抗原非特異性或敏感性低，而主要應(yīng)用于臨床輔助診斷中[8]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）因其較高的敏感性、特異性以及能夠提供病原微生物在體內(nèi)存在的直接證據(jù)而在臨床診斷中展示了廣闊的應(yīng)用前景[9，10]。本試驗運用PCR技術(shù)檢測自然感染華支睪吸蟲病患者糞便中的蟲卵，設(shè)計多對引物進行選擇，優(yōu)化試驗結(jié)果。因糞便中干擾因素較多，故基因組DNA的成功提取以及穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系的建立便成為開展該方面研究的前提，下一步可以利用蟲卵數(shù)對感染程度的影響進行PCR定量研究，為進一步探索分子生物學(xué)方法在華支睪吸蟲病診斷中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] XU L Q， YU S H，CHEN Y D. Clonorchiasis sinensis in China[J].Asian Parasitology Series Monograph，2005，1：1-22.

[2] LUN Z R，GASSER R B，LAI D H，et al.Clonorchiasis：a key foodborne zoonosis in China[J]. Lancet Infect Dis，2005，5（1）：31-41.

[3] STUNELL H，BUCKLEY O，GEOGHEGAN T，et al. Recurrent pyogenic cholangitis due to chronic infestation with Clonorchis sinensis（2006：8b）[J].Eur Radiol，2006，16（11）：2612-2614.

[4] 金寧一，胡伸明，馮書章，等.新編人獸共患病學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2007.789-799.

[5] HONG S T， HONG S J. Clonorchiasis sinensis in Korea[J].Asian Parasitology Series Monograph，2005，1：35-49.

[6] CHOI B I，HAN J K，HONG S T，et al.Clonorchiasis and cholangiocarcinoma：etiologic relationship and imaging diagnosis[J].Clin Microbiol Rev，2004，17（3）：540-552.

[7] M？譈LLER B， SCHMIDT J，MEHLHORN H. PCR diagnosis of infections with different species of opisthorchiidae using a rapid clean-up procedure for stool samples and specific primers[J].Parasitol Res，2007，100（4）：905-909.

[8] 蔣守富.重組華支睪吸蟲診斷抗原研究進展[J].中國病原生物學(xué)雜志，2007，2（2）：155-158.

[9] LIER T，SIMONSEN G S，HAAHEIM H，et al.Novel real-time PCR for detection of Schistosoma Japonicum in stool[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health，2006，37（2）：257-264.

[10] 陸正賢，許 靜，龔 唯，等.聚合酶鏈反應(yīng)檢測日本血吸蟲DNA的實驗研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2007，23（5）：479-483.