核桃GAI基因的克隆和序列分析

徐麗等

摘要：DELLA蛋白是赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)通路中一類重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子。利用RT-PCR技術(shù)以香玲核桃葉片為試材，克隆得到核桃DELLA蛋白基因JrGAI。對(duì)基因和編碼蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，JrGAI基因開(kāi)放閱讀框（ORF）為1 837 bp，編碼612個(gè)氨基酸；生物信息學(xué)分析表明，JrGAI編碼蛋白具有DELLA蛋白的典型結(jié)構(gòu)域；利用BLASTx和DNAMAN軟件進(jìn)行相似性分析發(fā)現(xiàn)JrGAI編碼蛋白氨基酸序列與其它植物的DELLA蛋白具有較高的同源性，其中與遼寧2號(hào)核桃同源性最高，達(dá)到99%。核桃JrGAI基因的克隆為其進(jìn)一步研究應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：核桃；DELLA蛋白；JrGAI基因；序列分析

中圖分類號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）07-0001-05

赤霉素（Gibberellins，GAs）是一類重要的生長(zhǎng)激素，能夠調(diào)控植物種子萌發(fā)、莖稈伸長(zhǎng)、花器官分化以及果實(shí)成熟等各個(gè)方面^[1]，DELLA蛋白是GA信號(hào)傳導(dǎo)通路上一個(gè)關(guān)鍵的生長(zhǎng)負(fù)調(diào)節(jié)因子。DELLA蛋白屬于GRAS（GAI，RGA，SCR）蛋白家族，實(shí)驗(yàn)表明，DELLA蛋白能阻遏植物生長(zhǎng)發(fā)育，GA通過(guò)作用于DELLA蛋白促使其降解，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)^[2～4]。模式植物擬南芥中有5個(gè)DELLA蛋白，分別是GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3^[5～7]。此外，玉米的D8、大麥的SLN1、水稻的SLR1和OsGAI、小麥的RTH1和葡萄的L1等基因的編碼產(chǎn)物也都屬于DELLA蛋白家族^[8～13]。目前有研究表明含DELLA蛋白結(jié)構(gòu)域的GAI基因發(fā)生突變，植株多表現(xiàn)出對(duì)GA不敏感的矮化特征，開(kāi)花延遲^{[8， 14， 15]}。

核桃（Juglans regia L.）是我國(guó)重要的干果樹(shù)種，在我國(guó)有著悠久的栽培歷史和廣泛的地理分布^[16]。目前核桃栽培多采用喬化密植栽培方式，導(dǎo)致樹(shù)體高大、樹(shù)冠郁閉、管理不便、影響通風(fēng)透光，以致果實(shí)品質(zhì)差、經(jīng)濟(jì)效益低。矮化密植栽培具有提早結(jié)果、管理方便、果實(shí)品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)。但是，采用人工雜交選育矮化新品種，往往需要10～20年的時(shí)間，周期長(zhǎng)、見(jiàn)效慢，如果將赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)向調(diào)節(jié)因子DELLA蛋白基因?qū)牒颂移贩N，使其株高降低，將有望培育出性狀優(yōu)良并適于矮化密植的新品種，對(duì)核桃生產(chǎn)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究從香玲核桃葉片中克隆得到包含ORF全長(zhǎng)的DELLA蛋白基因JrGAI，為進(jìn)一步研究DELLA蛋白功能并為核桃矮化品種的選育工作奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試核桃品種為香玲，香玲核桃組培苗保存在山東省果樹(shù)研究所國(guó)家核桃板栗資源圃。取生長(zhǎng)一個(gè)月的核桃組培苗葉片，液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

T4 DNA連接酶、pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；大腸桿菌DH5α、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為T(mén)IANGEN產(chǎn)品；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2核桃總RNA提取及RT-PCR

采用北京天根TIAN GEN RNA plant plus Reagent提取葉片總RNA，用DNaseⅠ（TaKaRa）消化去除RNA中的DNA。參照Fermentas公司說(shuō)明書(shū)，以O(shè)ligo（dT）18為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

1.3JrGAI基因的克隆

根據(jù)GenBank上發(fā)表的核桃DELLA蛋白基因序列（登錄號(hào)：JF766606.2），在基因兩端設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，上游引物P1：5′-CGGACCCTTTGGGAAACTCT-3′和下游引物P2：5′-ATGGAGGAGACAGGGACTTG-3′。以獲得的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，菌落PCR鑒定后由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4JrGAI基因序列分析和同源性比較

利用DNAMAN軟件分析JrGAI基因ORF，推導(dǎo)相應(yīng)的氨基酸序列，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；用NCBI（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTx和BLASTn進(jìn)行序列相似性分析；用ProtParam （http： //us.expasy.org/tools/ProtParam.html） 預(yù)測(cè)編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子量、等電點(diǎn)等理化特性；通過(guò)ProtScale軟件（http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.pl）進(jìn)行疏水性/親水性分析；用NCBI CD-Search service工具對(duì)JrGAI編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1JrGAI基因的克隆及同源性分析

進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在1 900 bp處出現(xiàn)特異性條帶，片段大小與預(yù)測(cè)值基本一致（圖1），將其命名為JrGAI。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLASTx比對(duì)，其編碼的氨基酸與其它物種的DELLA蛋白具有較高的相似性，其中與遼寧2號(hào)核桃（AEE69074.2）相似性最高，達(dá)到99%，與毛果楊（XP_002314799.1）、葡萄（AEK06229.1）和蘋(píng)果（AAY56751.1）的同源性均達(dá)到70%以上。

2.2JrGAI基因序列分析

用DNAMAN軟件分析表明，該基因序列包含1個(gè)1 837 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼一條由612個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。用ProtParam軟件預(yù)測(cè)JrGAI基因編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為66.66 ku；理論等電點(diǎn)（PI）為5.15；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為73，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為49；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)估算為45.41，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；理論推導(dǎo)半衰期大約為30 h；親水性平均數(shù)為-0.224，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。通過(guò)ProtScale軟件對(duì)蛋白質(zhì)整體分析顯示，親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)多肽鏈中，沒(méi)有明顯的疏水性區(qū)域，推測(cè)JrGAI編碼蛋白是一個(gè)親水性蛋白，與ProtParam軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致。利用NCBI CD-Search service 工具對(duì)JrGAI編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析表明，該序列N端氨基酸區(qū)域和C端氨基酸區(qū)域分別含有DELLA超級(jí)家族核心序列和GRAS超級(jí)家族核心序列（圖2）。

2.3JrGAI編碼蛋白序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用DNAMAN軟件比較DELLA蛋白氨基酸同源性，結(jié)果表明JrGAI編碼蛋白與數(shù)據(jù)庫(kù)中不同物種的DELLA蛋白具有較高的同源性，都具有GRAS家族所有的典型結(jié)構(gòu)域：N末端具有DELLA和TVHYNP結(jié)構(gòu)域，C末端具有RVER和SAW保守結(jié)構(gòu)域，以及中心區(qū)的VHVID、核定位區(qū)域（NLS）RKVATYFGLARR、起調(diào)節(jié)作用的LZ區(qū)域和poly S/T/V區(qū)域（圖3）。

分析核桃DELLA蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖 4）發(fā)現(xiàn)，十字花科的蕪菁、甘藍(lán)和擬南芥聚為一組；薔薇科的蘋(píng)果和湖北海棠聚為一組；豆科的菜豆和大豆聚為一組；葡萄科的葡萄和五葉地錦聚到一組；楊柳科的毛果楊與胡桃科的核桃因同屬于分類學(xué)上的原始類群在聚類分析結(jié)果中關(guān)系較近。DELLA蛋白在這些物種之間的進(jìn)化關(guān)系與這些物種在植物形態(tài)分類學(xué)上的地位一致，這充分顯示了DELLA蛋白在物種進(jìn)化上的保守性。

3討論

DELLA蛋白定位于細(xì)胞核中，是一類GRAS家族蛋白，N末端同源性總體上不高，但存在著DELLA和TVHYNP兩個(gè)非常保守的酸性結(jié)構(gòu)域，后面為亮氨酸重復(fù)序列LZ，中部有一個(gè)核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域（NLS），其后有一個(gè)保守氨基酸結(jié)構(gòu)域VHVID，在C端有RVER和SAW結(jié)構(gòu)域。有研究表明DELLA和TVHYNP結(jié)構(gòu)域是GA的信號(hào)感知區(qū)；VHVID、SAW等結(jié)構(gòu)域發(fā)揮阻遏作用；NLS結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄因子的標(biāo)志之一，含有NLS結(jié)構(gòu)域的蛋白可以從細(xì)胞質(zhì)定位到細(xì)胞核；LZ是二聚化結(jié)構(gòu)域^{[5，17，18]}。DELLA蛋白基因已在不同的物種中被廣泛鑒定，其功能也得以進(jìn)一步研究^{[8，11，19]}。Foster等^[20]克隆了蘋(píng)果DELLA蛋白家族6個(gè)基因，其中MdRGL2a與擬南芥GAI同源性為60%，將MdRGL2a轉(zhuǎn)入擬南芥進(jìn)行超表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出植株矮化、葉片緊縮、節(jié)間變短、開(kāi)花延遲等特征，類似于擬南芥GAI矮化突變體的表型特征^[21]。將擬南芥中的GAI基因?qū)胨具M(jìn)行表達(dá)， 可以引起水稻的矮化；在給定GA劑量條件下， 將缺失程度不同的GAI基因在水稻中表達(dá)， 可產(chǎn)生矮化程度不同的表型以及對(duì)GA不同程度的敏感性^[14]。以上研究表明DELLA蛋白功能較為保守，可引起植物的矮化。

本研究利用RT-PCR技術(shù)從核桃中克隆了DELLA蛋白基因JrGAI的ORF全長(zhǎng)，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)JrGAI編碼的蛋白與其它物種的DELLA蛋白在保守區(qū)域上高度一致，具有GRAS家族蛋白的特有結(jié)構(gòu)域，由此推測(cè)JrGAI編碼一個(gè)DELLA蛋白，并有可能參與核桃GA信號(hào)傳導(dǎo)。GA能調(diào)控植物莖的伸長(zhǎng)，從而決定植物的高度，因此，通過(guò)改變植物體內(nèi)GA的濃度或者對(duì)GA的敏感性都可能改變植物的高度，獲得矮化植株。GAI是GA信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的負(fù)調(diào)控因子，過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致植株矮化，表達(dá)量的高低與植株的高度呈負(fù)相關(guān)，因此，利用基因工程可以定向改變植物的高度。下一步將獲得的JrGAI基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以期得到理想的矮化植株，并對(duì)JrGAI基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證，該方面的研究具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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