VEGFR—3的表達(dá)與乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究

王學(xué)軍　王獻(xiàn)魁　許衛(wèi)衛(wèi)

【摘要】目的研究血管內(nèi)皮生長因子受體-3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）在乳腺癌中的表達(dá)，探討它的表達(dá)與乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義。方法應(yīng)用HE染色觀察乳腺癌的組織學(xué)形態(tài)和病理學(xué)變化；應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測乳腺癌患者癌組織、癌旁2cm乳腺組織及距癌組織5cm以上的正常乳腺組織中VEGFR-3的表達(dá)。結(jié)果免疫組化檢測顯示，VEGFR-3在乳腺癌腫瘤組織中的陽性表達(dá)率顯著升高（P<0.01）。在乳腺癌組織陽性表達(dá)率為63.33%（38/60）；在癌旁組織陽性表達(dá)率28.33%（17/60）；而正常組織成陰性表達(dá)（0/60）。VEGFR-3在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率分別為81.25%（26/32）和42.86%（12/28），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論VEGFR-3在乳腺癌中的表達(dá)均增高，明顯高于癌旁組織及正常乳腺組織。表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小、組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；VEGFR-3；微血管密度；免疫組化

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.07.001文章編號：1004-7484（2013）-07-3505-02

在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，且其發(fā)病率也在逐年上升，己成為威脅婦女健康的主要疾病。近年來在我國，特別是在一些大城市及經(jīng)濟(jì)發(fā)展較快的沿海地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率不斷上升，而且有年輕化的趨勢[1-2]。

腺癌可分浸潤性和非浸潤性兩大類。而浸潤性乳腺癌是乳腺癌的主要類型。乳腺癌的浸潤性是指癌細(xì)胞穿破乳腺導(dǎo)管或小葉腺泡的基底膜并浸入周圍組織。浸潤轉(zhuǎn)移的發(fā)生主要是由于癌細(xì)胞生長特性的改變而引起，使其脫離原發(fā)部位，通過血液及淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體的其它部位，并在新生部位發(fā)生增殖，形成新的轉(zhuǎn)移灶，并不斷侵襲轉(zhuǎn)移灶周圍的正常組織。

乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移是影響患者生存質(zhì)量和生存時間的重要因素。相關(guān)研究提示乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或血行轉(zhuǎn)移與否是對乳腺癌的臨床預(yù)后評估的重要指標(biāo)。

對于大多數(shù)腫瘤來說，淋巴道轉(zhuǎn)移是主要和首發(fā)的轉(zhuǎn)移途徑，腫瘤的淋巴結(jié)浸潤是評價腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)。血管內(nèi)皮生長因子受體-3是第一個被克隆的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記蛋白分子，同時也是一個重要的淋巴管內(nèi)皮生長調(diào)控因子。VEGFR-3與血管內(nèi)皮生長因子-C相互作用，調(diào)節(jié)淋巴管在胚胎階段的發(fā)育，誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增生，促進(jìn)新生淋巴管的延伸和新生淋巴竇發(fā)育，其在胚胎淋巴系統(tǒng)的形成過程中發(fā)揮著重要作用。在人類腫瘤組織中可見腫瘤周邊的新生淋巴管、有癌栓的淋巴管以及有腫瘤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)內(nèi)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-3表達(dá)增高，而且腫瘤內(nèi)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-3也呈陽性表達(dá)。這提示VEGFR-3高表達(dá)可能與乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。

在體內(nèi)，血管和淋巴管形成是密切相關(guān)的，組織中血管叢出現(xiàn)常伴隨淋巴管生長。雖然，淋巴管與血管的比例在不同的組織中不同；但充分的局部血供和氧供，是淋巴管的生長必要前提，并有助于淋巴管正常功能的發(fā)揮以及病理狀態(tài)下的快速再生以維持器官體液平衡。因此腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移與血管和淋巴管形成和生長有密切的關(guān)系。

本研究主要是通過檢測乳腺癌組織標(biāo)本中VEGFR-3的表達(dá)水平探討VEGFR-3表達(dá)與乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移的預(yù)防和臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1研究對象收集2010年3月至2010年12月駐馬店市第一人民醫(yī)院普外科手術(shù)切除的原發(fā)性乳腺癌病理標(biāo)本60例。所有患者均為女性，年齡32-73歲，中位年齡47歲。所有患者術(shù)前均未行任何化療、放療和內(nèi)分泌治療；均行乳腺癌改良根治術(shù)；其中浸潤性導(dǎo)管癌46例，浸潤性小葉癌14例，而且經(jīng)病理診斷確診為浸潤型乳腺癌。乳腺癌病理臨床分期采用國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2003年的TNM分期，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期28例，Ⅲ期17例；病理分級按Scarff-Bloom-Richardson分級法，Ⅰ級14例，Ⅱ級29例，Ⅲ級17例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例。取乳腺癌癌組織、癌旁2cm的乳腺組織及距癌組織5cm以上的正常乳腺組織各一塊，10%中性甲醛固定，生物自動脫水機(jī)處理后制成蠟塊備用。

1.2主要實驗儀器及試劑

1.2.1主要實驗儀器TS-12J生物自動脫水機(jī)（湖北孝感）；Leica SM2400切片機(jī)（德國Leica）公司；LeicaHi1210攤片機(jī)（德國Leica公司）；FA1104電子天平（上海精密儀器廠WD800TL23-K3）；微波爐（格蘭氏電器公司）；新飛組合變溫式冰箱BCP-205（新鄉(xiāng)新飛電器公司）；BX51/BX52系統(tǒng)顯微鏡（日本Olympus公司）；OLYMPUS直立光照照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2.2主要實驗試劑兔抗人乙酰肝素酶多克隆抗體（上海瑞奇生物科技有限公司）；鼠抗人CD34單克隆抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；兔抗人血管內(nèi)皮生長因子受體3多克隆抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；即用型二步法檢測試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色劑（福建邁新生物技術(shù)有限公司）。

1.2.3主要緩沖液、工作液

1.2.3.10.02M PBS液（pH7.2-7.6）配法1000ml蒸餾水中加入NaCl8.5g，Na2HPO4·12H2O7.05g，NaH2PO4·2H2O0.52g，（0.1M NaOH調(diào)平酸堿度）。

1.2.3.20.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）1000ml蒸餾水中加入枸櫞酸三鈉（C6H5NaO7·2H2O）3.0g，枸櫞酸（C6H8O7·H2O）0.4g，（0.1M NaOH調(diào)平酸堿度）。

1.2.3.310%緩沖中性甲醛固定液（500ml）440ml蒸餾水中加入Na2HPO4·12H2O 6.5g，NaH2PO4·2H2O 2.0g，40%甲醛60ml。

1.3研究方法

1.3.1組織切片的制備及染色

1.3.1.1組織切片制備步驟如下①乳腺組織標(biāo)本固定、脫水、透明、浸蠟和包埋：固定、脫水、透明、浸蠟于自動脫水機(jī)進(jìn)行。10%甲醛溶液固定8h，85%乙醇1h，90%乙醇1h，95%乙醇Ⅰ1h，95%乙醇Ⅱ1h，100%乙醇Ⅰ1h，100%乙醇Ⅱ1h，二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min，浸蠟Ⅰ2h，浸蠟Ⅱ2h，然后進(jìn)行手工石蠟包埋。②切片、攤片、烤片：制成3um厚切片，冰水中貼片，再于45度攤片水浴槽中攤片，再于63度烤片箱中傾斜45度放置，烤片4h。③脫蠟至水：從烤片箱中取出，即放入二甲苯Ⅰ1h，二甲苯Ⅱ1h，分別于100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇及70%乙醇各3min。

1.3.1.2HE染色蘇木精染色5min，自來水沖洗掉多余的染液，1%鹽酸酒精分化組織1min，自來水充分洗滌后細(xì)胞核呈紫藍(lán)色。然后，再用1%伊紅染色3min，自來水沖洗，85%乙醇20s，90%乙醇40s，95%乙醇Ⅰ1min，95%乙醇Ⅱ1min，100%乙醇Ⅰ2min，100%乙醇Ⅱ2min，二甲苯Ⅰ和Ⅱ各透明2min，用中性樹膠封片保存。

1.3.2免疫組織化學(xué)檢測

1.3.2.1標(biāo)本處理常規(guī)乳腺組織10%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，3um厚度切片。溫控儀電熱恒溫干燥箱內(nèi)58℃烤片1h。常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。

1.3.2.2方法即用型二步法（PV-6000）VEGFR-3表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測。

1.3.2.3染色步驟一抗為兔抗人血管內(nèi)皮生長因子受體3多克隆抗體（1：100），①蒸餾水洗滌組織標(biāo)本片2min×3次；②3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，室溫孵育10min。蒸餾水洗滌1min×2次；③微波抗原修復(fù)，高火5min，中火5min，取出后室溫冷卻20min；④PBS洗滌5min×3，滴加含5%BSA的封閉液，37℃恒溫箱孵育20min，甩去多余液體，不洗；⑤將標(biāo)本片置于1/150兔抗人乙酰肝素酶多克隆抗體/5%BSA封閉液中，4℃孵育過夜，PBS洗5min×3次；⑥滴加過氧化物酶連接的山羊抗兔lgG二抗液（1：10000），37℃恒溫箱孵育30min，PBS洗5min×3次；⑦DAB顯色，取1ml蒸餾水，加DAB顯色試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片標(biāo)本上，室溫下避光顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，蘇木素輕度復(fù)染，風(fēng)化，藍(lán)化，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。整個實驗過程中，用PBS代替一抗作空白對照。

1.3.3免疫組化結(jié)果判斷VEGFR-3的免疫組織化學(xué)結(jié)果以細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例來評定它們在組織中陽性表達(dá)率。高倍鏡下，每張切片在乳腺癌組織中隨機(jī)選取10個視野，每個視野隨機(jī)計數(shù)100個細(xì)胞。染色強(qiáng)度分級如下：無著色為0，淡棕黃色為1，棕黃色及更深顏色為2；陽性細(xì)胞數(shù)分級為：陽性細(xì)胞數(shù)≤50%為0，51%-75%為1，≥76%為2。兩項得分相加結(jié)果大于2為陽性表達(dá)病例。

1.3.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)均以χ±s表示，計數(shù)資料比較使用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗和單因素方差分析，采用Spearman法進(jìn)行相關(guān)分析。顯著性檢驗水平α=0.05。

2結(jié)果

VEGFR-3在乳腺癌組織中的表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，VEGFR-3在腫瘤細(xì)胞及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞均有陽性表達(dá)，陽性產(chǎn)物亦為棕黃色顆粒物質(zhì)。乳腺腫瘤組織內(nèi)有淋巴管出現(xiàn)，且淋巴管多分布于癌周邊間質(zhì)組織內(nèi)；而正常乳腺組織內(nèi)淋巴管數(shù)量較為稀少，且呈閉鎖狀態(tài)。

3討論

3.1VEGFR-3的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系血管內(nèi)皮生長因子受體-3，又名FLT4，為受體型酪氨酸蛋白激酶家族的成員，該受體為最早克隆出來的淋巴管內(nèi)皮特異性分子標(biāo)記物。

人的VEGFR-3基因位于5q33-q35區(qū)帶上，該基因具有高度保守性，其結(jié)構(gòu)與VEGFR-1、VEGFR-2相似，其由30個外顯子組成；編碼一個分子量為180kd膜蛋白，該蛋白序列由1298個氨基酸組成。VEGFR-3的配體有VEGF-C和VEGF-D兩種，但其主要與VEGF-C結(jié)合，VEGF-C主要通過VEGFR-3的調(diào)控介導(dǎo)淋巴管的生成。

目前認(rèn)為，VEGFR-3是正常成年人組織中淋巴管發(fā)育的特異性標(biāo)志物，也是體外培養(yǎng)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的唯一標(biāo)志物，在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中能保持特異性表達(dá)。它作為淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物，還能促進(jìn)淋巴管的發(fā)生和發(fā)育，是一個淋巴管生長的重要調(diào)節(jié)因子之一[3]。VEGFR-3在胚胎時期主要是誘導(dǎo)間質(zhì)中血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生與分化；隨著機(jī)體的逐漸發(fā)育，VEGFR-3在血管內(nèi)皮的表達(dá)量逐漸下調(diào)，在成人組織中只限制性地表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中。

關(guān)于淋巴管的生成機(jī)制，主要有兩個理論：①淋巴管內(nèi)皮來源于淋巴管母細(xì)胞。②靜脈以出芽方式形成淋巴管。由于毛細(xì)淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙較大，連接并不緊密，毛細(xì)淋巴管沒有連續(xù)的基膜，所以腫瘤細(xì)胞易于侵入淋巴管，并通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移率是隨著VEGFR-3陽性表達(dá)脈管比例增加而增加的。該研究提示乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能是通過VEGFR-3陽性表達(dá)脈管（淋巴管）來實現(xiàn)的。Roberts等[4]應(yīng)用動物模型研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制的研究中應(yīng)用VEGFR-3的抗體特異性阻斷VEGFR-3的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤的區(qū)域及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯受到了抑制。該研究直接證明了VEGFR-3在癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

參考文獻(xiàn)

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[4]Roberts N，Kloos B.Inhibition of VEGFR-3 activation with the antagonistis antibody more potently suppresses lymph node and distant metastases than inactivation of VEGFR-2 [J].Cancer Research，2006，66（5）：2650-2657.