金針菇菌種保藏效果的評價

阮秋菊

摘 要：研究利用保藏在-70℃超低溫冰箱的5個金針菇菌種（保藏期2年）和保藏在4℃冰箱的5個金針菇菌種（保藏期為6個月）為材料，比較和評價兩種保藏方法：（1）在PDA平板上兩種保藏方法在菌絲的宏觀形態(tài)、微觀形態(tài)上的差異；（2）在液體培養(yǎng)條件下比較其子實體的分化情況；（3）在固體培養(yǎng)條件下比較其子實體的分化情況。結(jié)果表明：（1）兩種不同的保藏方法金針菇在菌絲的宏觀形態(tài)、微觀形態(tài)上都沒有差異。菌絲的分枝、鎖狀聯(lián)合及橫隔都非常明顯，說明金針菇菌株沒有發(fā)生變異。（2）在液體培養(yǎng)條件下，實驗組和對照組的情況一致。（3）在固體培養(yǎng)條件下，所有菌種實驗組和對照組在子實體外觀形態(tài)上沒有特別明顯的差異，可以說明沒有發(fā)生變異。通過拮抗實驗觀察到不同保藏條件下的菌種之間沒有出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象，表明在-70℃低溫冰箱保藏2年后的菌種沒有發(fā)生基因的變異。

關(guān)鍵詞：金針菇 菌種保藏 保藏效果評定

中圖分類號：TS275 文獻標識碼：A 文章編號：1007-3973（2013）007-090-03

1 前言

1.1 金針菇概況

金針菇（Flammulina velutpes），隸屬真菌門、擔子菌亞門、蘑菇目、口蘑科、類火菇屬，是世界上著名的食藥兩用菌和觀賞菌。

1.2 營養(yǎng)價值

金針菇的營養(yǎng)保健作用日益引起人們的重視，目前以金針菇為原料加工的產(chǎn)品有金針菇豆奶、金針菇酸奶、金針菇醬、金針菇可樂、金針菇果凍、金針菇啤酒、金針菇菇脯、金針菇冰淇淋、金針菇掛面、金針菇火腿腸、金針菇保健飲料等。

金針菇的營養(yǎng)極其豐富，據(jù)日本學者研究指出，金針菇柄中含的大量食物纖維，有極好的食療作用，是一種極好的保健食品。

日本用金針菇菌絲體的醣噻胺的生物活性物質(zhì)來生產(chǎn)了一種新型的抗癌劑，治癌劑副作用小，用于外科手術(shù)后的輔助治療效果也十分明顯。

1.3 菌種保藏技術(shù)概況

金針菇的經(jīng)濟實用價值高，而種植金針菇的關(guān)鍵是優(yōu)良性狀的菌種。目前菌種保藏的方法包括：常規(guī)低溫繼代保藏、液氮超低溫保藏、冷凍干燥保藏、-86℃深度低溫保藏、石蠟封存、寄主保存、土壤保藏法、硅膠保藏法、濾紙條保藏法、蒸餾水保藏法等，其中液氮超低溫冷凍保藏法效果最好。但液氮保藏系統(tǒng)成本高，一般不能單獨依靠這一保藏技術(shù)。且液氮保藏的菌種必需培養(yǎng)在瓊脂培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中，不利于郵寄交流。Fritssdu首先在荷蘭Horst發(fā)現(xiàn)雜交菌株U1經(jīng)液氮保藏三年后出現(xiàn)退化，部分培養(yǎng)物產(chǎn)量下降，出現(xiàn)硬開傘，經(jīng)組織分離培養(yǎng)后，產(chǎn)質(zhì)量又恢復正常。分析表明：經(jīng)原生質(zhì)體重新融合產(chǎn)生的雜交菌株，其本身對不利因素（如超低溫的刺激）適應性差，在液氮保藏中必須考慮到這方面的影響；反復的冷凍和解凍也會使菌株受到不同程度的損傷。對菌種保藏方面所存在的相關(guān)問題有待更深入的研究。

1.4 菌種質(zhì)量檢測

食用菌菌種的生物學特征、對基質(zhì)分解能力、遺傳特征、生產(chǎn)出菇能力等方面需進行質(zhì)量檢測。正常的菌絲一般具有透明、分枝狀，有橫隔和明顯的鎖狀聯(lián)合；僅有單核菌絲，不具結(jié)實性異宗結(jié)合的食用菌不宜作菌種；鎖狀聯(lián)合多而密的雙核菌絲結(jié)菇力強，一般是好菌種。在適宜的條件下，若菌絲長速正常、粗壯、濃密、整齊，一般為優(yōu)質(zhì)菌種。最后通過拮抗試驗，觀察菌絲接觸區(qū)有無對峙反應。若無褐色的帶線出現(xiàn)，表示兩個受檢菌株的基因極相似或相同；反之，是不同的菌株。

本次實驗嘗試用低溫冰箱保藏菌種。須測定保藏后的菌種是否仍存活，有否變異。由于條件所限，只選5個菌種進行菌絲形態(tài)觀察、菌絲生長速度測量、液體及固體培養(yǎng)基出菇實驗和拮抗實驗。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

2.1.1 菌種

菌種是在-70℃冰箱用離心管保藏兩年的5株不同的金針菇菌種Fla2、Fla3、Fla4、Fla5、Fla7，及其在4℃冰箱用試管保藏半年的菌種。

2.1.2 培養(yǎng)基

（1）活化及菌絲觀察培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

（2）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。

（3）固體培養(yǎng)基：棉籽殼培養(yǎng)基。

2.2 方法

2.2.1 菌種的活化

在嚴格的無菌條件及超凈工作臺下操作。4℃冰箱常規(guī)保藏的菌種：從試管里取出包括氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的菌塊，然后接到PDA斜面中，每個種重復4次；-70℃冰箱離心管保藏菌種：同樣處理。接種后在22℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 平板菌絲培養(yǎng)

在PDA固體培養(yǎng)基表面放無菌蓋玻片，每個培養(yǎng)皿放3片。從活化菌種試管取大小相仿的菌塊進行接種，每個種接4個平板，每個溫度保藏的已活化菌種做2個平行。接種后在22℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，測量菌絲平均生長速度。

2.2.3 液體栽培出菇實驗

在超凈臺里，從活化菌種的試管里取出幾塊大小相仿的菌塊放進PDA液體培養(yǎng)基中，每個菌種接4瓶，兩瓶為4℃冰箱常規(guī)保藏的已活化的菌種，另兩瓶為-70℃冰箱離心管保藏的已活化的菌種。接種后置于22℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

2.2.4 固體栽培出菇實驗

按配方稱取各種成分，把糖溶于水中，與干料混合，攪拌均勻，裝袋。在1.5kg/cm2的壓力下，滅菌115min。培養(yǎng)基滅菌后冷卻到25℃左右時進行接種，整個過程都保證無菌操作。

接種后在22℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，對菌絲的生長速度進行測量，菌絲長到袋底表示培養(yǎng)階段結(jié)束。

培養(yǎng)階段結(jié)束后，把栽培袋移到菇房進行搔菌。氣溫控制在十幾到二十幾度左右，打開培養(yǎng)袋放在菇房里，每天噴水保濕，適當通風，當子實體長到約15cm時可采收。

2.2.5 拮抗實驗

培養(yǎng)基除不放蓋玻片外，其余與2.2.2平板菌絲培養(yǎng)的相同。在一個培養(yǎng)皿中接同一個種的不同溫度保藏的已活化的菌種，保證無菌操作，每個做2個平行，共接10個培養(yǎng)皿。接種后，在22℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌絲平均生長速度

3.1.1 平板培養(yǎng)菌絲日平均生長速度（見表1）

表1是平板培養(yǎng)菌絲的日平均生長速度，每個處理測3次。從表2可看到Fla3、4、5種內(nèi)的不同溫度下保藏后的菌種日平均生長速度的差異達到極顯著，F(xiàn)la7的兩種菌種的日平均生長速度的差異顯著，F(xiàn)la2的兩種菌種的日平均生長速度的差異不顯著?？偟亩?，在4℃冰箱保藏的菌種比在-70℃低溫冰箱保藏的菌種的生長速度要快。但菌種在4℃冰箱保藏的時間比在-70℃低溫冰箱保藏的時間要短，所以4℃冰箱保藏的菌種有可能恢復得比較快，造成其生長速度快。同時還有不可避免的人為誤差的存在。（說明：方差分析表中，A代表組間，E代表組內(nèi)，SS代表平方和，MS代表均方和，p代表顯著水平。）

3.1.2 固體栽培菌絲日平均生長速度（見表3）

表3是固體栽培菌絲的日平均生長速度，每個處理測三次。

從表4看到只有Fla5的菌絲日平均生長速度差異極顯著，是-70℃低溫冰箱保藏的菌種的生長速度快。Fla3、4種內(nèi)不同條件保藏的菌種生長速度差異顯著，是4℃冰箱保藏的菌種的生長速度快。而Fla2、7的種內(nèi)不同條件保藏的菌種生長速度差異不顯著，即認為數(shù)據(jù)上的差異可能是由試驗誤差引起的，如培養(yǎng)基裝袋時松緊度不同等。

表4中只有兩個菌種表現(xiàn)出在4℃冰箱保藏的菌種的生長速度與-70℃低溫冰箱保藏的菌種的生長速度有差異，而且是4℃冰箱保藏的長得快，與平板活化的情況一致。而其他三個菌種表現(xiàn)為無差異和差異極顯著，但差異極顯著的菌種卻是-70℃低溫冰箱保藏的菌種長得快，由此可以推斷在平板培養(yǎng)階段，由于-70℃低溫冰箱保藏的菌種已經(jīng)保藏了兩年時間，剛恢復生長時還不能體現(xiàn)它真正的活力，要經(jīng)過一定時間才能基本恢復到其原來的狀態(tài)了。

表3 固體栽培菌絲日平均生長速度（cm）

表4 固體栽培菌絲日平均生長速度方差分析

F0.01（1，4）=21.20，F(xiàn)0.05（1，4）=7.71， F0.1（1，4）=4.54

“**”代表差異極顯著，“*”代表差異顯著

3.2 菌絲顯微形態(tài)

金針菇屬低溫結(jié)實性真菌，菌絲體在5～32℃范圍內(nèi)均能生長，正常菌絲呈白色絨毛狀，有鎖狀聯(lián)合、橫隔和分枝。兩個不同保藏條件下的同一菌種的菌絲顯微形態(tài)沒有顯著的變異情況出現(xiàn)，菌絲的粗細，分支情況都大致相同。通過顯微鏡觀察，菌絲的鎖狀聯(lián)合、菌絲細胞間的橫隔都非常明顯。

3.3 出菇情況

3.3.1 液體栽培出菇情況

液體栽培實驗中，只有3個菌種長出了子實體，另外2個沒有子實體分化，對照組情況一致，這說明不是菌種出現(xiàn)了問題，可能是部分菌種不適宜用液體栽培，或是所需的條件不同。雖然子實體沒有形成，但菌絲長勢旺盛，用于菌絲球的培養(yǎng)或液體發(fā)酵是可行的。

3.3.2 固體栽培出菇情況

固體栽培每個菌種都出菇。結(jié)合液體出菇實驗，總的來看對照組與實驗組在子實體形態(tài)上沒有明顯的差異。

3.4 拮抗性

拮抗性是反映菌種的基因有否變異的一個重要實驗。實驗顯示對照組與實驗組的菌絲交界并不明顯，菌絲之間可以交錯生長，表明實驗組與對照組的菌種間沒有拮抗現(xiàn)象，說明實驗組菌種的基因沒有發(fā)生變異。在生長初期，絕大部分都是-70℃保藏的菌種菌絲長得比較快。同時菌絲在平板培養(yǎng)的狀況：白色絨毛狀，健壯，生長速度正常，7-8天就可長滿培養(yǎng)皿。

4 結(jié)論

菌種在-70℃低溫下保藏了2年而沒有發(fā)生退化和變異，用這種方法來長期保藏金針菇菌種是可行的。

5 討論

本次實驗證明了用超低溫冰箱代替液氮罐進行菌種的長期冷凍保藏是可行的，大大增加了冷凍保藏的實用性。而且放到冰箱里以后基本不需要任何的管理，非常方便。冷凍溫度為-70℃ ，但遠比普通冷藏溫度4℃低，從而有利于一般保藏菌種單位保持菌種種性和延長保藏時間。并可推知其他食用菌菌種也可以用這種方法來保藏，但還需要進一步的實驗來證明。

試驗采用小離心管作冷凍菌種的容器，不僅價廉易得，而且有很多型號可挑選，可根據(jù)單位實際空間大小來選擇。同時不需專用封口設備，保藏操作處理也方便。

從經(jīng)濟層面上說，遠比用液氮罐進行保藏的成本要低，也不需要像用4℃冰箱常規(guī)保藏那樣半年就得活化一次，活化的次數(shù)多了菌種容易退化、變異，節(jié)約人力物力的同時菌種變異的幾率也降低了。這次用的是保藏了兩年的菌種，這些菌種還能在這種條件下有效地保藏多少時間還有待研究。如果可以保藏3-5年，甚至更久的話，將為食用菌菌種的保藏節(jié)約更多的成本。

這次的菌種僅保藏了2年的時間，遠不能滿足需求，試驗將繼續(xù)進行。

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