基于LTR—FINDER分析葡萄基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子

李衛(wèi)濤 張煥麗 押輝遠(yuǎn)

摘要：運用LTR-FINDER對葡萄（Vitis vinifera）基因組中的19條染色體LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行分析。結(jié)果表明，葡萄基因組中19條染色體上共檢索到5 470個LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，約占葡萄基因組10.7%。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分析為進(jìn)一步開展葡萄品種鑒定和遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：葡萄（Vitis vinifera）；LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子；基因組

中圖分類號：Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1953-03

葡萄（Vitis vinifera）屬于葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis），為落葉藤本植物。目前全世界葡萄屬植物有70余種，幾乎占到全世界水果產(chǎn)量的1/4。中國約有38個葡萄品種，其分布之廣、產(chǎn)量之高、種類之多、特性之豐富，為全世界各國少有[1]。葡萄營養(yǎng)價值很高，其重要的用途就是釀制葡萄酒。遺傳多樣性在一定程度上決定了物種分布及數(shù)量多樣性，是生物多樣性研究的核心問題之一。通過對葡萄遺傳多樣性的研究，可以完整地認(rèn)識葡萄的進(jìn)化過程或適應(yīng)機(jī)理，種群的地理分布格局、數(shù)量增長、優(yōu)良品種選育、資源鑒別和利用以及病害檢測和防治等方面問題。

葡萄遺傳多樣性的研究是葡萄資源研究的重要方面。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，葡萄種質(zhì)資源的鑒定和分類研究已經(jīng)從形態(tài)學(xué)[2]、孢粉學(xué)[3]、細(xì)胞學(xué)[4]、酶學(xué)[5]水平發(fā)展到分子生物學(xué)水平上。分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳多樣性、作物品種純度鑒定、種質(zhì)資源分類、遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[6]。針對葡萄的分子標(biāo)記主要包括基于分子雜交技術(shù)的RFLP標(biāo)記和基于PCR技術(shù)的第一代分子標(biāo)記RAPD，第二代分子標(biāo)記AFLP、SSR以及第三代分子標(biāo)記STS、EST、SNP等[7]。REMAP和IRAP是基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子首先開發(fā)出來的兩種分子標(biāo)記方法[8]。REMAP是根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩端的LTR保守序列和微衛(wèi)星序列設(shè)計引物來檢測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與簡單重復(fù)序列之間的多態(tài)性。IRAP是一種檢測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入位點間多態(tài)性的分子標(biāo)記[9]，而LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物中拷貝數(shù)多，且散布于各染色體，非常利于分子標(biāo)記[10]。與常規(guī)分子標(biāo)記如AFLP、SSR、RAPD和ISSR相比，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子標(biāo)記不是在一個或少數(shù)核苷酸的位置檢測基因組的微小變異，而是檢測基因組中大的變異[11]，因而檢測的多態(tài)性信息含量明顯高于AFLP和SSR，特異性及重復(fù)性優(yōu)于RAPD和ISSR，靈敏性強于傳統(tǒng)分子標(biāo)記，尤其適用于遺傳背景高度同源的基因型鑒別[12]。目前反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子標(biāo)記已經(jīng)在柑橘（Citrus reticulata Blanco）、蘋果（Malus domestica）等種質(zhì)鑒定，大麥（Hordeum vulgare）遺傳圖譜構(gòu)建，水稻（Oryza sativa L.）、香蕉（Musa paradisiaca）、棉花（Gossypium spp.）、油橄欖（Olea europea L.）等遺傳多樣性檢測，燕麥（Avena sativa L.）[13]輔助選擇育種以及番茄（Solanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）[14]、煙草（Nicotiana tabacum）[9]等茄科作物遺傳多樣性研究等領(lǐng)域得到應(yīng)用，而基于IRAP和REMAP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于葡萄多態(tài)性的研究報道還比較少見，其主要原因是對葡萄的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沒有充分認(rèn)識。

本研究利用LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分析軟件LTR-FINDER分析了葡萄基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，為利用IRAP和REMAP分子標(biāo)記研究葡萄多態(tài)性品種鑒定和遺傳多樣性打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/map_search.cgi？taxid=29760）獲取葡萄基因組序列，根據(jù)LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基本特征，運用LTR-FINDER（http：//tlife.fudan.edu.cn/ltr_finder/）分析葡萄基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，完成基因組LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子測序。LTR-FINDER程序參數(shù)按照默認(rèn)值進(jìn)行設(shè)置。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄基因組LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分布特征

通過LTR-FINDER分析，得到LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在葡萄染色體上的分布情況見表1（堿基長度均不包括其中的gap長度）。由表1可知，葡萄基因組中19條染色體LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的比例含量最高的染色體是11號染色體（14.6%），比例含量最低的染色體是6和8號染色體（均為6.5%），基因組轉(zhuǎn)座子平均含量為10.7%。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子頻數(shù)最高的染色體是6號染色體（114 398 bp），頻數(shù)最低的染色體是11號染色體（59 326 bp），19條染色體上平均轉(zhuǎn)座子的頻數(shù)為77 897 bp。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子數(shù)目最多的染色體是14號染色體（386個），數(shù)目最少的染色體是6號染色體（188個），19條染色體上總的轉(zhuǎn)座子數(shù)目是5 470個。

2.2 葡萄及常見禾本科植物基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子含量比較

將葡萄基因組LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子含量與其他物種進(jìn)行比較（表2）。由表2可知，葡萄基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子含量雖然達(dá)到了10.7%，但相對于禾本科植物，其含量仍較低。植物L(fēng)TR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因進(jìn)化中主要通過引起基因突變、基因組重排、改變基因組大小等方式起作用，這些活動可以造成一系列的遺傳學(xué)效應(yīng)。離子束輻射、電離輻射、組織培養(yǎng)可以激活反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活性，增強反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性[15]。因此，葡萄LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子約占其基因組10.7%，含量相對較低，基因組相對穩(wěn)定，可以通過電離輻射等方式誘導(dǎo)葡萄基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，引起基因組染色體的不穩(wěn)定性，從而造成表型變化，為作物育種提供新的途徑和物質(zhì)基礎(chǔ)。同時LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活動也可能是造成葡萄品種多樣性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

3 小結(jié)與討論

隨著生物基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，正在改變對可轉(zhuǎn)座元件（Transposable element，TE）包括LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的研究方式。近年來，基因組測序技術(shù)的發(fā)展給LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子研究提供了廣闊的研究方向。如何從海量的序列基因組數(shù)據(jù)中有效而迅速地發(fā)現(xiàn)LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子已經(jīng)成為亟待解決的問題。21世紀(jì)初LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)和研究一直是試驗方法手工驗證，如印記、原位雜交和聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增等。目前研究者已經(jīng)積累了大量的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的知識經(jīng)驗，為構(gòu)建計算機(jī)模型建立了良好的基礎(chǔ)[16，17]。

可轉(zhuǎn)座元件是植物基因組的重要成分甚至是主要成分，它們的活動為植物基因組結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)化提供了重要機(jī)制，并參與塑造基因組的組織結(jié)構(gòu)與大小，影響基因的調(diào)控與變異。研究LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在葡萄基因組中的分布及特征對葡萄的深入研究起到重大作用。據(jù)研究報道，水稻、玉米和小麥中轉(zhuǎn)座子的含量分別為18.0%[16]，50.0%～80.0%[17]和90.0%[18]，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物基因組中拷貝數(shù)多，成簇分布。本研究中發(fā)現(xiàn)葡萄基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子平均含量達(dá)到10.7%，大約每77 897個堿基序列上就有一個LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，說明葡萄基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子含量較為豐富。實際上本研究只是針對葡萄基因組上全長LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行分析，而反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化過程中會大片段地缺失從而產(chǎn)生不完整，形成非全長的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，如片段LTRs、solo LTRs。因此，葡萄基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的成分要高于10.7%。葡萄基因組中有著豐富的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，符合IRAP和REMAP分子多態(tài)性技術(shù)研究的基本條件，可以利用基于LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子多態(tài)性技術(shù)研究葡萄的遺傳多態(tài)性，從而對葡萄的遺傳進(jìn)化和遺傳作圖及種質(zhì)資源利用等研究提供更好的分子生物學(xué)方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孔慶山.中國葡萄志[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2004. 16.

[2] 劉崇懷，帖 鋒，潘 興，等. 無核葡萄品種資源性狀的聚類分析[J].果樹學(xué)報，2006，23（4）：531-533.

[3] 邵鄰相，范曉萍.幾種蕓香科植物花粉形態(tài)觀察[J].果樹學(xué)報，2003，20（2）：146-148.

[4] 陳 俊，郭亞英，李太保.葡萄品種染色體數(shù)目觀察[J]. 山西果樹，1990（1）：13-14.

[5] 呂秀蘭，張光倫，龔榮高.22個葡萄品種過氧化物同工酶研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，23（2）：182-185.

[6] 石運慶，牟秋煥，李 鵬，等. DNA分子標(biāo)記及其在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 山東科學(xué)，2005，18（2）：22-29.

[7] 王 姣，劉崇懷，樊秀彩，等. 葡萄種類和品種鑒定技術(shù)研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報，2008，9（3）：401-405.

[8] KALENDAR R， GROB T， REGINA M， et al. IRAP and REMAP： Two new retrotransposon based DNA fingerprinting techniques[J]. Theor Appl Genet，1999，98（5）：704-711.

[9] 肖炳光，楊本超. 利用IRAP標(biāo)記分析烤煙品種間遺傳差異[J].西北植物學(xué)報，2006，26（6）：1119-1124.

[10] 趙海艷，王秋錦，孫清鵬，等. 茄子IRAP分子標(biāo)記體系的建立與優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（2）：75-80.

[11] 沈玉英，高志紅，王 飛，等.梅REMAP分子標(biāo)記技術(shù)體系的優(yōu)化及其應(yīng)用[J].西北植物學(xué)報，2011，31（4）：848-855.

[12] TAM S M， MHIRI C，VOGELAAR A， et al. Comparative analyses of genetic diversities with in tomato and pepper collections detected by retrotransposon-based SSAP， AFLP and SSR[J]. Theor Appl Genet，2005，110（5）：819-831.

[13] 陳志偉，吳為人. 植物中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及其應(yīng)用[J].遺傳，2004，26（1）：122-126.

[14] BI？魪MONT C， VIEIRA C. Genetics： junk DNA as an evolutionary force[J]. Nature， 2006， 443（7111）：521-514.

[15] YODER J A， WALSH C P， BESTOR T H. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites[J].Trends Genet，1997，13（18）：335-340.

[16] FLAVELL R B. Repetitive DNA and chromosome evolution in plants[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，1986，312 （1154）：227-242.

[17] MEYERS B C， TINGEY S V， MORGANTE M. Abundance， distribution and transcriptional activity of repetitive elements in the maize genome[J]. Genome Res， 2001，11（10）：1660-1676.

[18] GAO L， MCCARTHY E M， GANKO E W， et al. Evolutionary history of Oryza sativa LTR retrotransposons：a preliminary survey of the rice genome sequences[J]. BMC Genomics， 2004，5（1）：18.