NaCl脅迫對華山松種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

王瑞苓 汪元超 劉建祥 汪夢婷

摘要：以華山松為研究對象，探討了NaCl脅迫對華山松種子發(fā)芽和幼苗生長的影響。結果表明，在100 mmol/L及以下NaCl溶液濃度處理下，華山松種子均能正常發(fā)芽，幼苗也生長正常。在NaCl脅迫試驗濃度范圍內(nèi)，華山松種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、簡易活力指數(shù)、幼苗鮮重均呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，而幼苗干重呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化趨勢；幼苗體內(nèi)的可溶性糖、葉綠素、丙二醛含量及SOD活性也是隨著NaCl溶液濃度的提高呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，在50或100 mmol/L NaCl溶液濃度處理下達到最大，分別比無NaCl脅迫處理的提高了114.68%、12.46%、21.76%、293.51%。說明華山松耐NaCl脅迫的潛力相當可觀，作為耐鹽堿植物培養(yǎng)前景廣闊。

關鍵詞：華山松；NaCl；脅迫；種子；幼苗

中圖分類號：S791.241；Q948.113；S723.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1859-05

土壤鹽堿化是指土壤中可溶性鹽類隨水分向表層移動并積累下來，而使可溶性鹽含量超過0.3%的自然地質(zhì)過程[1]。土壤中的鹽分主要是風化產(chǎn)物和含鹽的地下水帶來的，灌溉水含鹽和施用生理堿性肥料也會使土壤中的鹽分增加。土壤鹽堿化后，土壤溶液的滲透壓增大，土體通氣性、透水性變差，養(yǎng)分有效性降低，使作（植）物不能正常生長。中國的土壤鹽堿化非常嚴重，現(xiàn)有鹽堿地0.99×108 hm2[2]。隨著環(huán)境的逐漸惡化，土壤鹽堿化的范圍不斷擴大，鹽堿程度越來越嚴重，每年因鹽堿化廢棄的土地約為25萬hm2，這給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[3]。華山松（Pinus armandii Franch.）是中國特有的針葉樹種，能適應多種土壤，廣泛分布于海拔1 000～3 500 m的地區(qū)[4]；由于其材質(zhì)好，果用經(jīng)濟價值很高，且為長江防護林的主要造林樹種，現(xiàn)在已經(jīng)被多個?。ㄊ校┕膭钔茝V種植；然而目前尚未見到有關華山松在鹽脅迫下的生理生化變化的文獻報道。因此，試驗開展了華山松在NaCl脅迫條件下的生理變化研究，以期為其在土壤鹽堿化土地上的生長提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

華山松種子購于云南省林木種苗站。挑選子粒飽滿、整齊一致的種子，清水洗凈，5% KMnO4溶液消毒30 min，去離子水清洗3次，再清水浸種4 h，備用。將種子放入鋪有雙層濾紙的已滅菌的培養(yǎng)皿中，分別用25、50、100、200、300 mmol/L 的NaCl（化學純）溶液處理種子，以去離子水為對照，3次重復，每重復100粒種子，然后在上面再覆蓋2層濾紙。將NaCl溶液處理過的華山松種子放入恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)發(fā)芽，每天光照8 h，光照度1 250 lx，并每天通風片刻，在發(fā)芽過程中及時補充水分[5]。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 種子發(fā)芽指標 從試驗的第一天開始每天觀察、記載發(fā)芽數(shù)，以華山松種子長出的胚根長度達到種子長度的1/2為種子發(fā)芽標志，每天定時統(tǒng)計各培養(yǎng)皿發(fā)芽的種子數(shù)目。根據(jù)國家林木種子檢驗規(guī)程[6]，在經(jīng)過21 d發(fā)芽后結束發(fā)芽試驗，試驗測定的種子發(fā)芽指標有發(fā)芽率、發(fā)芽勢、簡易活力指數(shù) （Simplied vigor index，SV）[6-8]。

發(fā)芽率（G）=最終發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽勢（Gv）=前3 d發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

簡易活力指數(shù)（SV）=平均苗長或鮮重×G，試驗選擇鮮重；

幼苗的鮮重為每個處理隨機取10株發(fā)育正常的幼苗，洗凈、晾干后在天平上稱取質(zhì)量，取單株均值；

幼苗的干重為每個處理隨機取10株發(fā)育正常的幼苗，洗凈、晾干后在烘箱里先105 ℃烘30 min、再80 ℃烘至恒重，冷卻后用天平稱出質(zhì)量，取單株均值。

1.2.2 幼苗生理生化指標 試驗測定的幼苗生理生化指標有可溶性糖（Soluble sugar）含量、葉綠素（Chlorophyll）含量以及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量。其中可溶性糖含量采用蒽酮法測定[9]，葉綠素含量采用分光光度法測定[9]；SOD活性采用氮藍四唑（Nitro-blue tetrazolium，NBT）法測定[9]；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid，TBA）法測定[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Microsft Office Excel 2003及SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析，并采用鄧肯氏新復極差法（Duncan′s new multiple-range test）分析比較[11]。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對華山松種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

2.1.1 NaCl脅迫對華山松種子發(fā)芽的影響 發(fā)芽率、發(fā)芽勢和簡易活力指數(shù)是評價種子發(fā)芽的常用指標，NaCl脅迫對華山松種子發(fā)芽的影響結果見表1，由表1可知，NaCl溶液濃度在0～100 mmol/L內(nèi)時，華山松種子的發(fā)芽率均在70%以上，發(fā)芽勢在40%以上，簡易活力指數(shù)在4.50以上；說明0～100 mmol/L的NaCl溶液濃度對華山松種子發(fā)芽指標的影響不大。進一步分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢與簡易活力指數(shù)在NaCl脅迫過程中的變化趨勢一致，都是先上升后下降；NaCl溶液濃度為25 mmol/L時發(fā)芽率、發(fā)芽勢與簡易活力指數(shù)達到最大，分別比對照提高了11.36%、20.13%和20.04%；隨著NaCl溶液濃度升高至200 mmol/L及以上后，華山松種子的各發(fā)芽指標急劇降低，而在300 mmol/L時的發(fā)芽率、發(fā)芽勢與簡易活力指數(shù)僅為對照的23.15%、24.82%和14.30%。

2.1.2 NaCl脅迫對華山松幼苗生長的影響 幼苗單株的鮮重和干重反映了植株在生長發(fā)育過程中有機物的積累和對水分吸收的能力，可在一定程度上評價幼苗在鹽脅迫下的生長發(fā)育能力[12-15]。NaCl脅迫對華山松幼苗鮮重的影響結果見圖1，對幼苗干重的影響結果見圖2。從圖1、圖2可見，隨著NaCl溶液濃度的提高，幼苗的鮮重呈先升高后下降的變化趨勢，而幼苗的干重持續(xù)下降。其中幼苗的鮮重在NaCl溶液濃度為25 mmol/L時比對照的鮮重增加了7.80%；而在50 mmol/L時幼苗鮮重與對照的鮮重差異不明顯。但是在各脅迫濃度下的干重均小于對照，其中在NaCl溶液濃度為300 mmol/L時，幼苗的鮮重和干重比對照分別下降了39.19%和34.16%。另外在試驗中發(fā)現(xiàn)，NaCl溶液濃度在0～100 mmol/L時，各處理幼苗的外部形態(tài)與對照相比目測差異不大；而在200 mmol/L及以上濃度時，幼苗的個體差異很大，高矮很不一致，大多數(shù)的幼苗根系呈黃褐色，甚至有的根系發(fā)育不完全，出現(xiàn)了許多畸形苗，而且很多種子在發(fā)芽過程中就已經(jīng)死亡，反映出NaCl溶液濃度在100 mmol/L時是個分水嶺，高于此濃度后大部分華山松種子或幼苗將無法承受脅迫壓力而結束生命。

2.2 NaCl脅迫對華山松幼苗生理生化指標的影響

2.2.1 NaCl脅迫對華山松幼苗可溶性糖含量的影響 植物在逆境中通常會在細胞液中積累一些可溶性糖來進行滲透調(diào)節(jié)，因此該指標常常被作為反映植物抗逆性強弱的指標之一[16，17]，NaCl脅迫對華山松幼苗可溶性糖含量的影響結果見圖3。由圖3可知，在NaCl脅迫下的幼苗體內(nèi)可溶性糖含量各處理均高于對照；隨著NaCl溶液濃度的提高，華山松幼苗體內(nèi)可溶性糖含量的變化呈先升高后降低的趨勢，以在100 mmol/L時幼苗體內(nèi)的可溶性糖含量最高，其比對照提高了114.68%。

2.2.2 NaCl脅迫對華山松幼苗葉綠素含量的影響 植物主要靠葉綠體進行光合作用，進行干物質(zhì)的積累，為自身的生長發(fā)育提供源源不斷的營養(yǎng)與能量，從而在外觀上表現(xiàn)出個體長大、成熟等現(xiàn)象[9]。而葉綠體中要靠葉綠素承擔收集、傳遞和轉(zhuǎn)換光能的重任，所以葉綠素含量對于光合作用至關重要，因此在鹽脅迫背景下植物葉綠素的含量高低體現(xiàn)了植物抗鹽脅迫能力的大小[18，19]，NaCl脅迫對華山松幼苗葉綠素含量的影響結果見圖4。由圖4可知，華山松幼苗的葉綠素含量變化趨勢與可溶性糖含量的變化相似，也是隨著NaCl溶液濃度的提高先升高后降低，其中在50 mmol/L時，葉綠素含量達到最大值，比對照的提高了12.46%。

2.2.3 NaCl脅迫對華山松幼苗SOD活性的影響 SOD是生物體內(nèi)防御活性氧（Reactive oxygen species，ROS）毒性的保護酶，它作為生物體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，能夠平衡機體內(nèi)的氧化物代謝。在正常情況下，植物體內(nèi)的羥基自由基（·OH）和超氧自由基（O2-·）等ROS的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)之中，如SOD可催化O2-·發(fā)生歧化反應而產(chǎn)生H2O2和O2，因而不會傷害植物細胞。但當植物處于鹽脅迫逆境時，由于膜脂過氧化使ROS的產(chǎn)生超過了SOD的清除能力，過量的強氧化物質(zhì)就會引起生物大分子的變性失活，使O2-·迅速增加，膜透性產(chǎn)生劇烈變化，使細胞內(nèi)的物質(zhì)外滲加快，加重植物體的損傷。因此SOD的活性體現(xiàn)了植物組織的抗氧化能力，在防御生物體氧化損傷及抵抗鹽脅迫等方面起著重要的作用[10，19-21]，所以SOD活性也可視為植物幼苗抗鹽脅迫能力大小的指標[22，23]。NaCl脅迫對華山松幼苗SOD活性的影響結果見圖5。由圖5可知，隨著NaCl溶液濃度的升高，華山松幼苗的SOD活性呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，如NaCl溶液濃度為50 mmol/L時，SOD活性達到最大，比對照的活性提高了293.51%，此后持續(xù)下降。但是各NaCl溶液濃度處理的SOD活性均高于對照，說明華山松幼苗在NaCl脅迫下可以通過提高自身的SOD活性來抵御鹽脅迫的不良影響。

2.2.4 NaCl脅迫對華山松幼苗MDA含量的影響 MDA是生物體內(nèi)膜脂過氧化的最終產(chǎn)物之一，能嚴重損害植物的細胞膜系統(tǒng)結構、干擾植物正常的生理代謝過程，其含量的高低與植物受害程度直接相關[24]。NaCl脅迫對華山松幼苗MDA含量的影響結果見圖6。從圖6可以看出，隨著NaCl溶液濃度的增加，華山松幼苗的MDA含量變化與可溶性糖含量的變化一樣，也是先升高后降低，在NaCl溶液濃度為100 mmol/L時MDA含量達到最大，比對照的含量提高了21.76%，不過在100 mmol/L濃度范圍內(nèi)幼苗的外觀形態(tài)表現(xiàn)正常。當然此時的細胞膜受害損程度如何，要待以后的顯微觀察和細胞學鑒定來判斷。

3 討論

試驗結果表明，在100 mmol/L的NaCl溶液濃度范圍內(nèi)，華山松種子均能正常發(fā)芽，發(fā)芽率都在70%以上，發(fā)芽勢在40%以上，簡易活力指數(shù)在4.50以上；而且幼苗生長正常，在外觀上各處理之間無明顯差異。在試驗設置的NaCl脅迫濃度范圍內(nèi)，隨著NaCl溶液濃度的提高，華山松種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和簡易活力均呈先上升后下降的變化趨勢。當NaCl溶液濃度為25 mmol/L時，發(fā)芽率、發(fā)芽勢與簡易活力指數(shù)均達到最大，分別比無NaCl脅迫的對照提高了11.36%、20.13%和20.04%；隨著NaCl溶液濃度升高至200 mmol/L及以上濃度后，華山松種子的3個發(fā)芽指標急劇降低，如在300 mmol/L時，華山松種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢與簡易活力指數(shù)分別僅為對照的23.15%、24.82%和14.30%，并且幼苗生長異常，個體差異很大。這個結果說明低濃度（25 mmol/L）的NaCl溶液可以促進華山松種子發(fā)芽與幼苗生長，而高濃度（200 mmol/L及以上）的NaCl溶液會對華山松種子的發(fā)芽造成極大的障礙，并嚴重影響幼苗的生長發(fā)育。同時，幼苗的干重隨著NaCl溶液濃度的升高而降低，說明幼苗需要消耗體內(nèi)的部分干物質(zhì)來啟動抗性機制[14，25]；而鮮重先升高后降低說明在一定范圍內(nèi)，幼苗可以通過提高對水分的吸收來稀釋體內(nèi)的NaCl，但當NaCl溶液濃度繼續(xù)提高時，由于外界水勢降低，幼苗就很難通過滲透吸水來達到抵御脅迫的目的[26]，進而造成幼苗的鮮重與干重不斷降低。

黃偉業(yè)等[27]研究報道，在NaCl脅迫毛竹[Phyllostachys heterocycla（Carr.）Mitford cv. pubescens Mazel ex H.de Lehaie]種子后，隨著NaCl濃度的提高，毛竹幼苗的SOD活性先增加后降低，這與本試驗的研究結果是一致的；并且華山松幼苗體內(nèi)的可溶性糖、葉綠素含量變化也呈這一趨勢。試驗中的SOD活性與可溶性糖含量這2個指標均高于無NaCl脅迫的對照。這說明在一定的NaCl脅迫范圍內(nèi)，華山松幼苗可以通過滲透調(diào)節(jié)（積累可溶性糖）增強體內(nèi)抗性酶（SOD）的活性，提高光合作用中光能收集、傳遞和轉(zhuǎn)化的能力，從而抵御不良環(huán)境。但林蘭英等[28]認為，植物的這種能力是有限的，隨著脅迫的加劇，這些能力會不斷下降。

張慧蓉等[29]在研究鹽脅迫對野生地膚[Kochia scoparia（L.）Schrad.]幼苗生長的影響時，將中性鹽NaCl、Na2SO4和堿性鹽NaHCO3、Na2CO3按不同比例混合，模擬出30種與天然鹽堿土壤相似的鹽含量條件；結果發(fā)現(xiàn)，隨著混合鹽脅迫濃度的升高，MDA的含量在逐漸增加，而本試驗的結果表明，華山松幼苗體內(nèi)的MDA含量隨著NaCl溶液濃度的增加表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，個中原因可能是在高濃度的NaCl傷害時，華山松幼苗的膜傷害不僅僅是膜脂過氧化加劇造成的，還有其他的傷害存在[30，31]；也可能是高濃度的NaCl激活了體內(nèi)其他抗鹽脅迫的途徑，當然這需要下一步的試驗來驗證。

植物在幼苗期是對外界環(huán)境最敏感的時期[32]，因此該時期鹽脅迫幼苗造成的傷害也是最直接、最嚴重的[33]。試驗通過華山松種子發(fā)芽、幼苗生長這短短21 d的觀察記錄，發(fā)現(xiàn)華山松幼苗能在100 mmol/L以內(nèi)的NaCl溶液濃度范圍內(nèi)正常生長；如此推算，那么華山松成年植株很有可能將會在更高鹽濃度環(huán)境下正常生長，其耐NaCl脅迫的潛力還是相當可觀的；因此加快華山松耐鹽脅迫能力的開發(fā)對于擴大引種、改良鹽堿地是非常有價值的。不過我們?nèi)匀恍枰M一步探討華山松大苗或者成年植株的鹽濃度耐受范圍，通過抗鹽鍛煉、施用植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等方法[34，35]提高華山松的抗鹽性，以及通過基因改良、不斷選優(yōu)[36]等方法，使這種優(yōu)良林木的耐鹽脅迫遺傳特性持續(xù)強化并保留下來，以此推動華山松在我國大片的鹽堿地上廣為引種栽培；這不但可以對鹽堿地積極治理，還可以創(chuàng)造更多的物質(zhì)財富。

參考文獻：

[1] 趙可夫，李法曾.中國鹽生植物[M].北京：科學出版社，1997.

[2] 張建峰，張旭東，周金星，等.世界鹽堿地資源及其改良利用的基本措施[J].水土保持研究，2005，12（6）：28-30.

[3] 孫建昌，王興盛，楊生龍.植物耐鹽性研究進展[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2008，26（1）：226-230.

[4] 方瑞征.中國植物志·第57卷第一分冊 [M].北京：科學出版社，1999.

[5] 張建峰，宋玉民，邢尚軍，等.鹽堿地改良利用與造林技術[J].東北林業(yè)大學學報，2002，30（6）：124-129.

[6] GB 2772-1999，國家林木種子檢驗規(guī)程[S].

[7] 陶嘉齡，鄭光華.種子活力[M].北京：科學出版社，1991.110.

[8] 喻方圓，周景莉，洑香香.林木育苗質(zhì)量檢驗技術[M].北京：中國林業(yè)出版社，2008.70-77.

[9] 郝建軍，康宗利，于 洋.植物生理學實驗技術[M].北京：化學工業(yè)出版社，2007.

[10] 李合生.植物生理生化試驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2007.

[11] 余建英，何旭宏.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與SPSS應用[M].北京：人民郵電出版杜，2003.

[12] 趙可夫，范 海，江行玉，等.鹽生植物在鹽漬土壤改良中的作用[J]. 應用與環(huán)境生物學報，2002，8（1）：1-5.

[13] 穆俊麗，李建科，楊靜慧，等.不同油葵品種種子萌發(fā)期的耐鹽性研究[J].北方園藝，2009（5）：26-30.

[14] 汪貴斌，曹福亮.鹽脅迫對落羽杉生理及生長的影響[J].南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2003，27（3）：11-14.

[15] 周 滈，卓麗環(huán)，張 荻，等.NaCl脅迫對偃伏梾木幼苗生理的影響[J].東北林業(yè)大學學報，2007，35（1）：13-16.

[16] BRAY E A. Molecular responses to water deficit[J]. Plant Physiology，1993，103（4）：1035-1040.

[17] DOWNTON W J. Osmotic adjustment during water stress protects to the photosynthetic apparatus against photoinhibition[J]. Plant Science Letter，1983，30（2）：137-143.

[18] 李景生，黃韻珠.淺述植物的耐鹽生理[J]. 植物學通報，1995，12（3）：15-19.

[19] 肖 雯，賈恢先，蒲陸梅.幾種鹽生植物抗鹽生理指標的研究[J].西北植物學報，2000，20（5）：818-825.

[20] 馬文月.植物抗鹽性研究進展[J].農(nóng)業(yè)與技術，2004，24（4）：95-99.

[21] 李國雷，孫明高，夏 陽，等.NaCl脅迫下黃櫨、紫荊的部分生理生化反應動態(tài)變化規(guī)律的研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2004，35（2）：173-176.

[22] 孫紅葉，李 利，劉國軍，等.剛毛檉柳種子萌發(fā)對鹽分與干旱脅迫的響應[J].干旱區(qū)地理，2007，30（3）：414-419.

[23] 馬小衛(wèi)，郭春會，羅 夢.核殼、鹽和水分脅迫對長柄扁桃種子萌發(fā)的影響[J].西北林學院學報，2006，21（4）：69-72.

[24] 張恩平，張淑紅，司龍亭，等.NaCl脅迫對黃瓜幼苗子葉膜脂過氧化的影響[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2001，32（6）：446-448.

[25] 顏 宏，趙 偉，陳文靜，等.不同鹽溶液浸種對向日葵種子萌發(fā)的影響[J].種子，2007，26（2）：69-72.

[26] 馬煥成，王沙生.胡楊膜系統(tǒng)的鹽穩(wěn)定性及鹽脅迫下的代謝調(diào)節(jié)[J].西南林學院學報， 1998，18（1）：15-23.

[27] 黃偉業(yè)，楊 麗，張智俊.NaCl脅迫對毛竹種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].種子，2009，28（10）：16-22.

[28] 林蘭英，陳 剛.金線蓮組織培養(yǎng)中若干因素的研究[J].亞熱帶植物通訊，1993，22（2）：7-11.

[29] 張慧蓉，張建偉，張兆沛，等.鹽堿脅迫對野生地膚種子發(fā)芽和幼苗生長的影響[J].種子，2010，29（1）：15-19.

[30] 莊偉偉，李 進，曹滿航，等.NaCl與干旱脅迫對銀沙槐幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響[J]. 西北植物學報，2010，30（10）：2010-2015.

[31] 孫方行，孫明高，夏 陽，等.NaCl處理對海棠滲透調(diào)節(jié)的影響[J]. 西北林學院學報，2005，20（3）：62-64.

[32] 王凌暉，施福軍，朱宏光，等.鹽分脅迫下巨尾桉苗期生長與生理特性的變化[J].福建林學院學報，2009，29（2）：174-177.

[33] KHAN M A， SHEITH K H. Effect of different levels of salinity on seed germination and growth of Capsicum annuum[J]. Biolo J，1996，22：15-16.

[34] 張海燕，趙可夫.鹽分和水分脅迫對鹽地堿蓬幼苗滲透調(diào)節(jié)效應的研究[J]. 植物學報，1998，40（1）：56-61.

[35] 張秀玲，李瑞利，石福辰.鹽脅迫對羅布麻種子萌發(fā)的影響[J]. 南開大學學報（自然科學版），2007，40（4）：13-18.

[36] 馬雅琴.小麥種質(zhì)資源的耐鹽性鑒定及其相關基因的挖掘[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2004.