四尾柵藻對壬基酚脅迫的響應(yīng)研究

劉莉莉+王成

摘 要：選取水體中廣泛存在的四尾柵藻為代表，研究其在營養(yǎng)鹽限制條件下對壬基酚脅迫的響應(yīng)。實驗設(shè)置3個暴露組（0.041、0.103、0.205mg·L-1）和1個對照組（0mg·L-1），測定了96h內(nèi)四尾柵藻細胞密度、胞外多糖合成、最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）以及群體形態(tài)等變化。結(jié)果顯示，隨著NP暴露濃度的增加，四尾柵藻的密度、Fv/Fm 等指標的下降幅度更加顯著；0.041mg·L-1NP暴露對四尾柵藻的生長、葉綠素a含量以及Fv/Fm等均有促進作用，說明四尾柵藻在NP暴露下能夠產(chǎn)生毒物刺激效應(yīng)現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：壬基酚；四尾柵藻；脅迫；毒性效應(yīng)

中圖分類號 X592 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）12-24-04

Study on Scenedesmus quadricanda Responses to Nonylphenol Stress

Liu Lili1 et al.

（1 Jianghuai College of Anhui University，Hefei 230031，China）

Abstract：In order to study the physiological effects of NP on the fresh algae，Scenedesmus quadricanda was exposed to NP of three concentrations（0.041、0.103、0.205mg·L-1） and a control（0mg·L-1） . Its cell number、maximum light conversion efficiency （Fv/Fm） 、extracellular polysaccharide and cell morphology were measured in 96h exposure. Results show that the cell number and Fv/Fm of microalgae were increased in 0.041mg·L-1 NP ，with the increasing of concentrations of NP， the cell number and Fv/Fm of microalgae were decreased，the growth of Scenedesmus quadricanda was inhibited.

Key words：Nonylphenol；Scenedesmus quadricanda；Stress；Toxic effect

壬基酚（Nonylphenol，NP），分子式C15H24O，由苯環(huán)和9個碳原子的碳鏈組成，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用，中國年產(chǎn)量約為30 300t，其中的60%會排入污水處理系統(tǒng)并最終排入水環(huán)境中[1]。近年來，我國一些重要的自然水體中均已發(fā)現(xiàn)NP的存在，并且由于其不易降解的特性導(dǎo)致環(huán)境中的NP含量不斷累積[2]。水域生態(tài)系統(tǒng)主要初級生產(chǎn)力淡水微藻對水域生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著十分重要的作用，因其個體小、繁殖快、對毒物敏感等特點，已成為評價水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測的重要指標[3]。在富營養(yǎng)化的淡水水域中，四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）是常見的優(yōu)勢藻種之一[4]。

目前，在淡水微藻室內(nèi)毒理實驗過程中，BG11是常用的淡水藻類培養(yǎng)基，其ρ（TN）和ρ（TP）分別為247.06mg·L-1和7.11mg.L-1，而在自然水體ρ（TN）、ρ（TP）濃度遠遠低于培養(yǎng)基[5-6]。本文主要研究在近似水體營養(yǎng)鹽條件下四尾柵藻對壬基酚脅迫的響應(yīng)，包括四尾柵藻細胞密度、最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、胞外多糖含量以及細胞群體形態(tài)的變化，以期為合理評價該類污染物對水域生態(tài)系統(tǒng)的影響提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 5401-CC275TL型智能人工氣候箱，UV-2450型紫外-可見分光光度計，Handy PEA植物效率分析儀等。壬基酚純品購自上海晶純實業(yè)有限公司。

1.2 藻種及培養(yǎng)條件 實驗藻種四尾柵藻由暨南大學(xué)水生生物研究所藻種室提供，培養(yǎng)溫度為（23±1）℃，光照強度100μmol·m-2·s-1，光暗比為12h（L）∶12h（D）。

1.3 實驗設(shè)計 采用營養(yǎng)鹽濃度減少為原濃度1/10的BG-11培養(yǎng)基。無菌條件下，將處于指數(shù)生長期的四尾柵藻離心（3 500rpm，5min，24℃），經(jīng)無菌蒸餾水反復(fù)清洗后接種于1/10的BG-11培養(yǎng)基中，靜置饑餓4d后用于實驗。實驗采用丙酮作為助溶劑，配制丙酮的6個體積濃度系列：0、1、3、5、7和10‰，96h培養(yǎng)后用血球計數(shù)板顯微計數(shù)，測定藻細胞的密度，計算得到丙酮對四尾柵藻不可見效應(yīng)劑量（No observed effect level，NOEL）為5‰。將預(yù)處理過的藻液接種到1/10 BG-11培養(yǎng)基中，接種密度為8.63×105cells·mL-1。NP質(zhì)量濃度分別為0（加5‰丙酮作為對照）、0.041、0.103和0.205mg·L-1。每個實驗設(shè)置3個平行，每天搖瓶至少3次，培養(yǎng)96h。

1.4 測定方法

1.4.1 藻細胞密度的測定 每隔24h取樣，血球計數(shù)板計數(shù)。每個樣品計數(shù)3次，取其平均值。

1.4.2 最大光能轉(zhuǎn)化效率的測定 每隔24h取樣，測量前將待測藻液暗適應(yīng)20min。利用Handy PEA植物效率分析儀測定最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）。

1.4.3 胞外多糖含量的測定 每隔24h取樣，將藻液通過0.45μm濾膜過濾，吸取2.0mL濾液加入25mL比色管中，以葡萄糖作為標準，用硫酸苯酚法測定胞外多糖的含量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 四尾柵藻細胞密度變化對NP暴露的響應(yīng) 不同質(zhì)量濃度NP對四尾柵藻的細胞密度的影響如圖1。由圖1可知，四尾柵藻細胞起始密度為8.63×105cells·mL-1，在培養(yǎng)過程中，NP質(zhì)量濃度為0.041mg·L-1處理組細胞密度始終均比同期對照組高，藻細胞數(shù)量顯著增加，最終為對照組的1.13倍，差異顯著（P<0.05）；在0.103mg·L-1NP處理組中藻細胞密度相比對照組無顯著差異（P>0.05）。在96h后，0.205mg·L-1NP暴露會抑制藻細胞數(shù)量的增加，顯著低于對照組（P<0.05），為對照組的74%。表明低濃度的NP對四尾柵藻的生長有促進作用，高濃度的NP抑制了四尾柵藻的生長，0.205mg·L-1NP處理組藻體顏色相比處理組變淺。

2.2 四尾柵藻最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）對NP暴露的響應(yīng) NP暴露對四尾柵藻Fv/Fm的影響如圖2所示。由圖2可知：96h后，0.041mg·L-1NP處理組明顯提高了四尾柵藻光系統(tǒng)（PSⅡ）的Fv/Fm（n=3，P<0.05），0.103、0.205mg·L-1NP處理則降低了四尾柵藻的Fv/Fm。

2.3 四尾柵藻胞外多糖合成對NP暴露的響應(yīng) 如圖3所示，培養(yǎng)結(jié)束后，0.205mg·L-1處理組四尾柵藻細胞胞外多糖含量最高，為對照組的1.05倍，0.041mg·L-1處理組中細胞胞外多糖含量低于對照組，且始終低于同期對照組。

2.4 NP暴露對四尾柵藻群體形成的影響 不同質(zhì)量濃度NP對四尾柵藻細胞群體形態(tài)的影響如圖4所示。由圖4可知，實驗初始階段，對照組和處理組中四尾柵藻單細胞、雙細胞和多細胞群體形態(tài)相對比例為69.2%、22.78%、0.08%，培養(yǎng)期間，NP質(zhì)量濃度0.041mg·L-1處理組中四尾柵藻非單細胞群體相對比例基本均低于對照組；而0.102、0.205mg·L-1處理組中非單細胞群體相對比例在96h后分別比對照組高出3.4%、14.1%。

3 結(jié)論與討論

NP對生物的影響是多方面的，通過本次實驗研究表明，低濃度（0.041mg·L-1）的NP對四尾柵藻的生長有一定的促進作用，細胞密度與對照組相比也有所增加，F(xiàn)v/Fm也有所提高。Fv/Fm反映的是PSII反應(yīng)中心原初光能轉(zhuǎn)化效率，即最大光化學(xué)效率，可以反應(yīng)植物所受脅迫程度以及植物的光合效能[8]。實驗結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度（0.041mg·L-1）NP暴露促進了四尾柵藻藻Fv/Fm的升高，這與王山杉等人在固氮魚腥藻的研究相一致[9]。所以低質(zhì)量濃度NP對四尾柵藻生長的刺激效應(yīng)，很可能是因為NP暴露提高了微藻的Fv/Fm，促進了細胞中光合色素和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化合成，從而刺激了微藻細胞相對較快的增長繁殖，致使單個細胞所負擔(dān)污染物濃度降低，且受損藻細胞逐漸恢復(fù)的結(jié)果。

而在NP暴露濃度為0.205mg·L-1的處理組中，柵藻細胞中雙細胞、多細胞群體明顯增多，與單細胞相對比例增大，高于對照組。四尾柵藻群體特征的出現(xiàn)，說明原先的單細胞表面的黏性增強，也就是說與細胞表面粘性有關(guān)的胞外多糖含量可能增高了。而本實驗通過測定培養(yǎng)過程中四尾柵藻細胞胞外多糖合成的變化也證實了這一點，處理組中藻細胞胞外多糖含量顯著高于對照組?？梢姡奈矕旁迦后w的形成與胞外多糖分泌量密切相關(guān)，與楊州在銅綠微囊藻中的研究相一致[10]。由于藻類群體的形成，減小了其比表面積和包裹效應(yīng)（package-effect）的影響，使得藻類群體單位體表面積吸收的光能減少[11]，影響了光合作用的進行；同時，群體形態(tài)的維持需要更多的能量用于合成胞外多糖，減少了其他成分（如蛋白質(zhì)、脂肪）的合成量，從而不利于細胞的增殖和生長[12]。實驗測定的細胞密度和Fv/Fm的變化也證實了這一點。

低濃度NP暴露對四尾柵藻的生長、葉綠素a含量以及Fv/Fm等均有促進作用，這表明四尾柵藻可以通過在身代謝的調(diào)整來適應(yīng)低濃度的NP脅迫，低濃度的NP對四尾柵藻產(chǎn)生了毒物刺激效應(yīng)現(xiàn)象，在一定程度上促進了四尾柵藻細胞的代謝活動，增強了其光合作用效能，其中的促進機理有待于進一步的研究。

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（責(zé)編：張宏民）