深黃被孢霉突變株A35—4產(chǎn)多不飽和脂肪酸發(fā)酵條件優(yōu)化

劉尚杰 巴敏 許本波 田志宏 謝伶俐

摘要：以深黃被孢霉（Mortierella isabellina）突變株A35-4為材料，通過單因素試驗及正交試驗探討了發(fā)酵條件對A35-4產(chǎn)多不飽和脂肪酸的影響。結(jié)果表明，突變株A35-4的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為60 g/L果糖、3 g/L牛肉膏、3 g/L磷酸二氫鉀、0.6 g/L MgSO4、2.0 g/L檸檬酸鈉、1.0 g/L菜子油，初始pH 6.0，先28 ℃培養(yǎng)4 d，然后20 ℃培養(yǎng)3 d。

關(guān)鍵詞：深黃被孢霉（Mortierella isabellina）；多不飽和脂肪酸；優(yōu)化；發(fā)酵

中圖分類號：Q815 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1920-04

多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs）及其衍生物在大腦發(fā)育、過敏反應(yīng)及心血管運(yùn)動等一系列生理功能中發(fā)揮重要作用，具有維護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能、治療心血管疾病、抗炎、抗癌、促進(jìn)大腦發(fā)育、減肥以及增加動物的產(chǎn)仔率和成活率等生理功能[1-7]。隨著人類生活水平的提高，運(yùn)動量的減少，PUFAs對人類的健康就顯得越來越重要。長期以來人們都是從動植物油脂中提取PUFAs，但動植物的生長受到季節(jié)、地理位置等的影響而使PUFAs含量變動較大，提取成本高，周期長，不能適應(yīng)市場的需要，且動植物油脂資源含油量及不飽和脂肪酸類型、比例均受到一定的限制。因此，近年來人們一直在探索利用誘變育種等技術(shù)，對現(xiàn)有產(chǎn)PUFAs菌株進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高PUFAs的含量。開發(fā)微生物 PUFAs 可以部分或完全取代動物、植物中的 PUFAs，有著廣闊的市場前景[8，9]。

袁成凌等[6]采用不同誘變方法對高山被孢霉（Mortierella alpina）進(jìn)行誘變育種，獲得多株花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA）高產(chǎn)菌株，ARA 產(chǎn)量最高達(dá)到7.43 g/L，王嘯等[10]對深黃被孢霉（As3.2793）進(jìn)行復(fù)合誘變獲得突變株MUI0310，ARA 產(chǎn)量為 0.73 g/L。目前產(chǎn) PUFAs 的出發(fā)菌株多為被孢霉屬真菌，但由于野生菌株產(chǎn)PUFAs的能力很低，因此急需利用誘變育種等方法培育出高產(chǎn)菌株[11，12]。

在前期研究中，以深黃被孢霉As3.3410為出發(fā)菌株，利用微波誘變和紫外誘變，乙酰水楊酸與低溫（15 ℃）相結(jié)合的篩選方法，獲得1株高產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株A35-4[13]，其生物量為17.9 g/L，油脂含量為67.8%，油脂產(chǎn)量為12.12 g/L，PUFAs含量為20.3%，PUFAs產(chǎn)量為2.46 g/L，連續(xù)斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)證實該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。本研究探討了深黃被孢霉突變株A35-4的發(fā)酵條件，對其培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到深黃被孢霉突變株A35-4發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成和合適的產(chǎn)脂條件，為工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 深黃被孢霉突變株 A35-4由購自中國科學(xué)院微生物研究所的深黃被孢霉As3.3410誘變篩選得到。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基為 PDA 培養(yǎng)基（土豆瓊脂培養(yǎng)基）：200.0 g/L馬鈴薯，20.0 g/L葡萄糖，20.0 g/L瓊脂，于1×105Pa滅菌20 min。種子培養(yǎng)基：100.0 g/L葡萄糖，1.0 g/L磷酸二氫鉀，0.3 g/L硫酸鎂，2.0 g/L酵母膏，2.0 g/L硫酸銨，pH 6.1，于1×105 Pa滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 搖瓶種子培養(yǎng)：取活化7 d的PDA菌種斜面，用5 mL無菌水洗下孢子，倒入裝有50 mL搖瓶種子培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，于28 ℃以180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。搖瓶產(chǎn)脂培養(yǎng)：取培養(yǎng)48 h的搖瓶種子培養(yǎng)液2 mL接入裝有 100 mL產(chǎn)脂培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中，于28 ℃以180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。

1.2.2 分析方法 油脂含量定量分析：索氏抽提法[14]。氣相色譜分析： PUFAs含量的氣相色譜測定委托中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所測試中心完成。

1.2.3 單因素試驗 ①溫度對突變株發(fā)酵的影響。在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）條件下探討發(fā)酵溫度對突變株生產(chǎn)和產(chǎn)脂的影響。菌株固定接種量為2%，以180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。②碳源對突變株發(fā)酵的影響。在基本產(chǎn)脂培養(yǎng)基中分別添加濃度均為100 g/L的葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖和乳糖，配制成含不同碳源的產(chǎn)脂培養(yǎng)基。菌株固定接種量為2%、以180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。③氮源對突變株發(fā)酵的影響。在基本產(chǎn)脂培養(yǎng)基中分別添加濃度均為3 g/L的酵母膏、硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏、蛋白胨和尿素，配制成含不同氮源的產(chǎn)脂培養(yǎng)基。菌株固定接種量為2%，以180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。④金屬離子對突變株發(fā)酵的影響。在基本產(chǎn)脂培養(yǎng)基中分別添加濃度均為0.5 g/L的Na2SO4、FeSO4、MgSO4、ZnSO4和Ti（SO4）2，配制含不同金屬離子的產(chǎn)脂培養(yǎng)基。菌株固定接種量為2%，以180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。⑤添加植物油對突變株發(fā)酵的影響。在基本產(chǎn)脂培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)均為0.1%的橄欖油、大豆油、芝麻油、花生油和菜子油，配制成含植物油的產(chǎn)脂培養(yǎng)基。菌株固定接種量為2%，以180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。

1.2.4 正交試驗 以基本產(chǎn)脂培養(yǎng)基+2.0 g/L檸檬酸鈉+1.0 g/L菜子油為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的果糖、牛肉膏、磷酸二氫鉀和MgSO4，初始pH 6.0，菌株接種量為2%，先于28 ℃培養(yǎng)4 d，然后于20 ℃培養(yǎng)3 d，接下來收集菌體并測量PUFAs含量，計算PUFAs產(chǎn)量。采用四因素三水平的正交試驗L9（34）優(yōu)化深黃被孢霉突變株的產(chǎn)脂培養(yǎng)基配方。試驗的因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對突變株發(fā)酵的影響

由圖1可知，菌絲生長和油脂合成的最適溫度不一致，在10 ℃時由于溫度過低，突變株菌絲幾乎停止生長，25～30 ℃的溫度適合于菌絲生長，菌絲大量繁殖。15～20 ℃適合于油脂積累，因此在試驗中采取先在28 ℃使其菌絲增殖，再降低培養(yǎng)溫度至20 ℃，使其積累油脂。

2.2 碳源對突變株發(fā)酵的影響

由表2可知，以果糖為碳源時，生物量和油脂含量均較大，說明果糖是突變株A35-4合成油脂的較好碳源。

2.3 氮源對突變株發(fā)酵的影響

由表3可知，酵母膏和牛肉膏較適合菌體生長，蛋白胨和牛肉膏較有利于油脂合成，綜合考慮各氮源對油脂產(chǎn)量的影響，確定牛肉膏為A35-4生長和產(chǎn)油脂的合適氮源。

2.4 金屬離子對突變株發(fā)酵的影響

由表4可知，添加FeSO4時油脂產(chǎn)量最高，但各處理間油脂產(chǎn)量沒有顯著差異。

2.5 添加植物油對突變株發(fā)酵的影響

Shinmen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加植物油對微生物積累油脂有促進(jìn)作用。由表5可知，在基礎(chǔ)產(chǎn)脂培養(yǎng)基中分別添加花生油、菜子油、大豆油、芝麻油和橄欖油，都能不同程度地促進(jìn)菌絲體的生長及菌絲體中油脂的積累，其中菜子油效果最好，生物量提高了30.31%，油脂含量提高了16.04%，這可能是因為植物油中都含有豐富的油酸和亞油酸，這些脂肪酸既可作為碳源又可作為合成PUFAs等的前體物被利用。

2.6 果糖、牛肉膏、MgSO4、磷酸二氫鉀濃度對發(fā)酵產(chǎn)PUFAs的影響

由表6可知，基本產(chǎn)脂培養(yǎng)基中添加果糖、牛肉膏、磷酸二氫鉀、MgSO4的最佳組合為A1B2C3D3，即60 g/L果糖、3 g/L牛肉膏、3 g/L磷酸二氫鉀和0.6 g/L MgSO4。在基本培養(yǎng)基+60 g/L果糖+3 g/L牛肉膏+3 g/L磷酸二氫鉀+0.6 g/L MgSO4+2.0 g/L檸檬酸鈉+1.0 g/L菜子油，初始pH 6.0，先28 ℃培養(yǎng)4 d，然后20 ℃培養(yǎng)3 d的條件下進(jìn)行驗證試驗，得到PUFAs的最高產(chǎn)量達(dá)到3.6 g/L。

3 小結(jié)與討論

自1988年Shimizu等[16]報道高山被孢霉是進(jìn)行γ-亞麻酸（GLA）商業(yè)化生產(chǎn)的潛在資源以來，國內(nèi)外對產(chǎn)GLA的微生物進(jìn)行了大量研究。為提高GLA含量，研究人員主要通過物理或化學(xué)手段改變菌株遺傳物質(zhì)，然后進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。1996年Hiruta等[17]以拉曼被孢霉為出發(fā)菌株，經(jīng)過亞硝基胍誘變，采用抗低溫篩選方法，獲得一株突變株，經(jīng)過培養(yǎng)條件優(yōu)化后其GLA含量高達(dá)18.3%。陳波等[18]以深黃被孢霉為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變，用抗脂肪酸脫氫酶抑制劑抑芽丹的篩選方法，獲得深黃被孢霉突變株，其GLA含量是出發(fā)菌株的1.07倍。李忠玲等[19]以少根根霉為出發(fā)菌株，利用紫外線誘變結(jié)合失水蘋果酰肼篩選的方法，選育出突變株，搖瓶培養(yǎng)后菌體油脂含量為35.55%，其中GLA占油脂的12.5%，比原始菌株油脂含量提高了93.94%，GLA含量提高了276.5%。李麗娜等[20]采用微波誘變并結(jié)合乙酰水楊酸對深黃被孢霉進(jìn)行篩選，獲得一株高產(chǎn)菌株，其生物量為30.85 g/L，總油脂含量為15.5 g/L，花生四烯酸（ARA）濃度為2.61 g/L，ARA產(chǎn)量比原始對照菌株提高3.18倍，并且遺傳性能穩(wěn)定。

在前期試驗中，通過誘變結(jié)合低溫篩選的方法，得到高產(chǎn)菌株A35-4，但其生物量低[13]。本研究通過單因素試驗及正交試驗，對突變株A35-4發(fā)酵生產(chǎn)PUFAs的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定突變株A35-4最佳產(chǎn)脂培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件為：60 g/L果糖、3 g/L牛肉膏、3 g/L磷酸二氫鉀、0.6 g/L MgSO4、2.0 g/L檸檬酸鈉、1.0 g/L菜子油，初始pH 6.0，先28 ℃培養(yǎng)4 d，然后20 ℃培養(yǎng)3 d。

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