鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的分離和初步鑒定

章華偉 鐘超群

摘要： 以野生藥用植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為研究對(duì)象，采用無(wú)菌操作技術(shù)分離到內(nèi)生細(xì)菌23株，其中來(lái)源于根、莖、葉的分別為7株、8株、8株。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和染色等，初步鑒定了鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌具有7個(gè)屬，包括土壤桿菌屬（Agrobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、泛菌屬（Pantoea）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostridium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）。研究豐富了我國(guó)細(xì)菌資源，為鐵皮石斛內(nèi)生菌資源的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；內(nèi)生細(xì)菌；分離；鑒定

中圖分類號(hào)：Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）08-1811-03

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬藥用植物，主要分布在我國(guó)云南、浙江、廣西、貴州等地區(qū)。鐵皮石斛具有抗腫瘤、抗輻射、抗血小板凝集、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中草藥[1]。隨著需求量的日益增加，野生鐵皮石斛被無(wú)序采集，自然資源日趨減少，部分種類已瀕臨滅絕。植物內(nèi)生菌作為一種重要的微生物資源，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，也是新型天然活性物質(zhì)的重要來(lái)源之一[2]。然而，在我國(guó)藥用植物開(kāi)發(fā)和利用中，對(duì)內(nèi)生菌的研究相對(duì)較少，目前已研究涉及的藥用植物內(nèi)生菌只有300余種，這相對(duì)于我國(guó)豐富的藥用植物資源（11 146種）還相差很遠(yuǎn)。因此，開(kāi)展我國(guó)藥用植物內(nèi)生菌研究，特別是其生物多樣性和化學(xué)多樣性研究是非常必要的。目前，關(guān)于鐵皮石斛內(nèi)生菌多樣性的研究已有報(bào)道[3-6]，但僅限于其內(nèi)生真菌的研究。研究采用形態(tài)學(xué)鑒定方法，系統(tǒng)分離鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌，為豐富我國(guó)細(xì)菌資源和促進(jìn)鐵皮石斛保護(hù)性開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物來(lái)源 新鮮健康野生鐵皮石斛于2011年10月采自浙江天臺(tái)山，保持整棵植株的完整性帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存，24 h內(nèi)處理。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，氯化鈉5 g，瓊脂16 g，去離子水1 000 mL；分離培養(yǎng)基：每毫升NA培養(yǎng)基中加入100 IU兩性霉素B，用于內(nèi)生細(xì)菌分離純化。NB培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，氯化鈉5 g，去離子水1 000 mL；半固體培養(yǎng)基：牛肉膏1.8 g，蛋白胨4 g，葡萄糖20 g，酵母浸出液1.3 g，NaCl 3 g，Na2HPO4 1 g，MgCl2 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂為5 g，去離子水1 000 mL，用于穿刺培養(yǎng)[7]。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化 鐵皮石斛植株用清水沖洗干凈后，選取適量根、莖、葉，在75%乙醇中浸泡30 s，再置于2%次氯酸鈉中5～10 min（根和莖消毒10 min，葉消毒6 min），用無(wú)菌水沖洗4次后，在無(wú)菌條件下將根和莖切為0.5 cm長(zhǎng)的小段，葉切為0.5 cm × 0.5 cm的小片。選取根、莖、葉各10小段（片）作為鐵皮石斛供試組織材料接入分離培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d。每天定時(shí)檢查內(nèi)生細(xì)菌長(zhǎng)出情況，及時(shí)挑取切口處新長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落，并轉(zhuǎn)移到NA培養(yǎng)基中，純化培養(yǎng)直至獲得單一純菌株。最后，將獲得的純菌株轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，供觀察鑒定和保藏。同時(shí)，用最后一次漂洗供試材料的無(wú)菌水涂布于分離培養(yǎng)基平板上作為對(duì)照，同樣條件下培養(yǎng)觀察，確保樣品表面徹底消毒，保證分離到的菌株確實(shí)是內(nèi)生細(xì)菌[8-10]。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的初步鑒定 內(nèi)生細(xì)菌的初步鑒定參照文獻(xiàn)[11，12]的方法進(jìn)行。

1）菌落形態(tài)觀察。將純菌株接到NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察，記錄每個(gè)菌落的大小、形狀、顏色、含水狀態(tài)、菌落透明度、邊緣情況以及菌落形成速度等，同時(shí)觀察記錄液體培養(yǎng)過(guò)程中菌落性狀，觀察其在試管中的生長(zhǎng)部位，得出其對(duì)氧的需求情況。

2）革蘭氏染色。取干凈載玻片，滴一滴去離子水，用接種針挑取菌齡為20 h的菌苔少許，均勻涂布在載玻片上，風(fēng)干固定；用含結(jié)晶紫的混合染液染色約1 min后水洗；碘液作用約1 min水洗，吸干；用95%乙醇或丙酮乙醇溶液脫色至無(wú)色（約30 s）；用番紅液染色5～6 min后水洗，風(fēng)干；鏡檢。

3）莢膜染色。采用濕墨水法進(jìn)行莢膜染色，菌齡72 h，操作步驟為：加一滴墨水于潔凈的載玻片上，挑取少量菌體與其混合均勻；蓋上蓋玻片，取一張濾紙放在蓋玻片上，輕輕按壓以吸去多余的混合液；仔細(xì)觀察，若背景灰色，菌體較暗，菌體周圍呈現(xiàn)明亮的透明圈，即為陽(yáng)性，說(shuō)明有莢膜；反之則為陰性，表示無(wú)莢膜。

4）穿刺培養(yǎng)。將按上述配置好的半固體培養(yǎng)基滅菌后，待其冷至50 ℃左右，用無(wú)菌移液管轉(zhuǎn)入試管中，培養(yǎng)基約占管體的1/3，并將其置于試管架中，待其冷卻后，將NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的菌體用接種針蘸取菌液，迅速插入半固體培養(yǎng)基試管中，并迅速取出接種針，此過(guò)程要求動(dòng)作迅速，不拖沓。穿刺培養(yǎng)細(xì)菌可用于厭氧性或兼性厭氧性細(xì)菌的培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)菌自穿刺部位的擴(kuò)散狀況來(lái)了解細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性能。

5）芽孢染色。將菌齡為48 h的細(xì)菌固定在載玻片上，滴加5%孔雀綠染液，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，約維持8～10 min，加熱過(guò)程中要隨時(shí)添加染色液，保持濕潤(rùn)，切勿讓標(biāo)本干涸；待玻片冷卻后用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無(wú)染色液為止；再用番紅液染色5 min后水洗，晾干或吸干水分，鏡檢，如呈綠色，表明有芽孢存在，如呈紅色，表示沒(méi)有芽孢。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌分類鑒定

通過(guò)系統(tǒng)分離純化，從鐵皮石斛中共獲得內(nèi)生細(xì)菌菌株23株，其中來(lái)源于根、莖、葉的分別為7株、8株、8株。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和染色等，初步鑒定了鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌屬于7個(gè)屬，包括土壤桿菌屬（Agrobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、泛菌屬（Pantoea）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostridium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus），表明鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌具有一定的生物多樣性。鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的種類及其主要特征見(jiàn)表1，土壤桿菌和泛菌為分離頻率較高的優(yōu)勢(shì)菌種，而黃桿菌和葡萄球菌的分離率較低，其中黃桿菌僅在鐵皮石斛葉子中存在。

2.2 鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌種類分布情況

鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌種類分布情況見(jiàn)表2。表2結(jié)果表明，鐵皮石斛的莖、葉和根中含有不同種類和數(shù)量的內(nèi)生細(xì)菌，根中含有內(nèi)生細(xì)菌菌株7株，屬于5個(gè)屬；莖中有內(nèi)生細(xì)菌8株，屬于4個(gè)屬；葉中含有內(nèi)生細(xì)菌8株，屬于5個(gè)屬。在分離到的鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌中，泛菌屬和土壤桿菌屬的數(shù)量最多，各5株，其次為芽孢桿菌屬4株，而黃桿菌屬數(shù)量最少，僅有1株。鐵皮石斛內(nèi)生菌雖然普遍存在于其所有營(yíng)養(yǎng)器官中，但也表現(xiàn)一定的宿主特異性，如梭菌存在于所有的營(yíng)養(yǎng)器官中，而黃桿菌只存在葉中；根中沒(méi)有葡萄球菌，莖中沒(méi)有泛菌和乳桿菌，葉不存在土壤桿菌和芽孢桿菌。

3 小結(jié)與討論

鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌含有較豐富的生物多樣性，具有有一定的組織、宿主差異性。研究不但豐富了我國(guó)細(xì)菌資源，而且為鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的生物活性物質(zhì)篩選和開(kāi)發(fā)鐵皮石斛資源提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。同時(shí)，建議在藥用植物內(nèi)生菌生物多樣性研究之前，必須確定合適的采樣方法，除采集新鮮、健康植株外，還應(yīng)擴(kuò)大采樣數(shù)量和采樣地點(diǎn)，這樣內(nèi)生菌的種類可能還會(huì)增加[13]。關(guān)于鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的種名還需要采用分子生物學(xué)手段和生理生化試驗(yàn)來(lái)確定，如16 S rRNA序列分析等，這些工作還有待進(jìn)一步研究。

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